李全杰，徐鋼春(.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫2408:2.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇無錫2408)

魚類精子和卵子的質量是影響魚類繁殖性能的關鍵因素之一。它們與胚胎的發(fā)育及仔、稚、幼魚的成活率和生長都有直接關系，當然，也與后期的養(yǎng)殖效率也密切相關［1］。同時，在魚類的繁殖過程中精子與卵子質量受到越來越多的關注。許多研究初步證實了熱休克蛋白的存在會影響卵子精子的質量。在魚類生殖細胞形成的過程中熱休克蛋白也會隨之而表達，但是由于熱休克蛋白的形成主要受到環(huán)境等外界因素的影響，因此到目前為止如何控制熱休克蛋白的表達還未找到更好的方法。為此，筆者從魚類生殖細胞的發(fā)生發(fā)育、熱休克蛋白的作用機理、影響因素及熱休克與生殖細胞的調節(jié)機制等方面對目前熱休克蛋白對魚類生殖的影響的相關研究現(xiàn)狀進行了概述，并對存在的問題和需要進一步重點研究的相關主題進行了探討，以期加強熱休克蛋白對魚類生殖細胞的有利影響，進一步優(yōu)化親魚的繁育，進而促進魚類繁殖的健康、可持續(xù)發(fā)展，提高我國水產品的產量和質量。

1 魚類生殖細胞的發(fā)生發(fā)育

徐紅艷等［2］研究表明魚類和其他大多數(shù)動物一樣，胚胎發(fā)育產生生殖細胞系或種質系和體細胞系。這2個細胞系的分離發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期，其標志是形成生殖細胞系的祖細胞，即原始生殖細胞(Primordial germ cells，PGCs)。PGC形成后從再遷移到性原基，然后就發(fā)育成為性原細胞，即卵原細胞和精原細胞;隨后在經(jīng)過配子生成的一系列發(fā)育過程后，最終產生成熟的配子——卵子和精子。生殖細胞發(fā)育的每個步驟都可能影響生物個體的生殖能力或育性。在魚類及許多其他的生物中，生殖細胞在胚胎發(fā)育早期就已形成而且是由原原始生殖細胞(pPGC)發(fā)育而來的［2］。pPGC是生殖細胞的始祖，能進行細胞不對稱分裂，產生2個“命運各異”的子細胞:其中1個是體細胞，而另1個仍為pPGC。但當2個子細胞“命運相同”且都能發(fā)育成生殖細胞時，其母細胞就成為了原始生殖細胞(PGCs)。在生殖腺形成前，PGC便已在胚胎的特定位置特化形成，隨后PGC遷移穿過各種胚胎組織(細胞組織)到達正在形成中的原始生殖腺，即性原基。因此，PGC可相應地分為遷移前、遷移中和遷移后3種。一旦到達性原基，PGC便結合并協(xié)同周圍體細胞形成一個完整的生殖腺［3］。在某些物種的初始生殖腺，如老鼠的初始生殖腺中PGC到達性原基后便會停止有絲分裂且進入有絲分裂靜止期(G0)期。這些G0期生殖細胞通常也被稱為生殖母細胞或性原細胞，在魚類性成熟期間生殖母細胞發(fā)育變成生殖干細胞(卵原細胞或精原細胞)，在性成熟期間最終分化形成成熟的配子，即在雄性個體中形成精子，在雌性中形成卵子。在研究初期，有人用顯微鏡觀察形態(tài)學的方法分析了PGC的特有細胞結構——生殖質顆粒(Nuage)，并對多種魚的生殖細胞進行了初步考察。同時，Hamaguchi在細胞超微結構水平上對生殖質顆粒在魚類生殖細胞發(fā)育期間的形成進行了觀察研究［4］。在10年前這些開創(chuàng)性研究就得以被歸納與總結。隨后，其他一些魚類生殖細胞特異基因也陸續(xù)被分離鑒定。此外，各種細胞和分子實驗技術也在魚類研究應運而生并得以發(fā)展，使得在過去10年內科學界對生殖細胞的研究無論是在理論知識的積累方面還是實踐應用方面都取得了很大進步［5］。

2 熱休克蛋白的作用機理

熱休克蛋白(Heat shock protein，HSPs)是一類結構上高度保守的蛋白質，廣泛存在于從原核類的細菌到哺乳動物的細胞中［6］。當細胞受環(huán)境刺激(溫度的升高、缺氧、病毒感染、營養(yǎng)缺乏、暴露于化學物質下)時，即可產生此類蛋白。因此，熱休克蛋白又稱為應激蛋白。各種生物的熱休克蛋白在進化上均具有高度的保守性，甚至其編碼基因的進化也是如此。人類與細菌類的熱休克蛋白具有50%以上的同源性［7］。對應激后熱休克蛋白的表達方式和種類進行研究，有人用哺乳動物5種不同種系細胞熱休克后熱休克蛋白的表達進行試驗，結果發(fā)現(xiàn)它們的表達方式和種類極其相似。

目前，對于HSP尚無明確的分類標準。一般根據(jù)應激蛋白的調節(jié)模式不同，通常分為2大類:HSP和調節(jié)蛋白(CRPs)。另外，也有研究表明，可以根據(jù)相對分子質量的大小及同源程度，將其分為4個家:HSP90家族(分子量83～90 kD)、HSP70家族(分子量66～78 kD)、HSP60家族和小 HSP家族以及分子量分別為110～111 kD和相對分子質量8 000，且性質不同于上述家族的大分子HSP和泛素蛋白［8］。

3類蛋白質HSP90、HSP60和HSP70都有各自的結構和生物學功能，但是現(xiàn)在對HSP的研究中對HSP70家族的結構、功能以及表達調控機理的研究較為深入，在正常情況下HSP70位于細胞漿內，當細胞受到熱休克的刺激時細胞內只有少量存在，細胞處于恢復階段時細胞核內的HSP70就會消失，但是細胞漿內仍有低水平的HSP70表達。HSP家族中，HSP70家族是一類最保守也是最重要的，包括分子量為68、72、73、75、78 kD的多種蛋白，用雙向電泳和質譜分析對其進行分析，發(fā)現(xiàn)其具有相同的酸性等電點和相近的胰蛋白酶肽譜［9］。HSP70 基因分布廣泛，位于第 1、5、6、14 及 21 號染色體上，其表達和分泌的蛋白具有ATP酶區(qū)和底物識別區(qū)2個結構域［10］。這種結構特點不但能使HSP70可利用ATP水解產生的能量，還能與其他功能蛋白進行結合、分離，最終能夠完成蛋白的轉運、合成以及變性蛋白的清除。

HSP對溫度有一定的敏感性，如當環(huán)境溫度高于細胞生長溫度2～8℃時，HSP會在細胞內迅速積累。在此溫度范圍內，細胞內的HSP基因轉錄迅速增加，其他基因的轉錄降低，接著HSP mRNA選擇性轉錄，HSP也就會隨之增加［11］。HSP基因在應激時細胞內的激活機制在進化上是非常保守的。有人認為熱休克因子與熱休克原件的結合及HSP基因的轉錄是真核細胞HSP基因的轉錄調節(jié)過程。

3 熱休克蛋白及其在生殖中的作用

3.1 熱休克蛋白在生殖組織中的表達 人類與生殖相關的許多組織中均有HSPs的存在。在健康女性的周期性變化的子宮內膜中就有HSPs的表達。在孕早期的人類蛻膜中就可以檢測到HSPs。無論是正常的還是異常的懷孕婦女的輸卵管中都可檢測到不同的HSPs。排卵后，子宮內膜中表達大量的HSP27、HSP60和HSC70。研究表明，雌激素和孕酮的受體都與HSP有關，這些HSPs在子宮內膜中表達暗示它們參與對激素功能的調節(jié)［12］。

3.2 熱休克蛋白的精子發(fā)生 精子發(fā)生過程中有3個不同并且重要的階段:精原細胞的有絲分裂、精母細胞的減數(shù)分裂和圓形精子的發(fā)育及精子成熟期［4］。大量的轉錄和細胞分化事件在這些不同的發(fā)育階段都會發(fā)生，因此伴隨著不同的HSPs的表達。在不育的雄性動物中，由HSP60的低水平表達導致了保護水平的降低。研究發(fā)現(xiàn)，減數(shù)分裂的失敗與精原細胞的凋亡的增加有關，在小鼠精子形成過程中需要HSP70－2基因的參與才能完成減數(shù)分裂。HSP70可能作為精子表面抗原，與支原體感染性不育癥中對硫糖脂基團的識別，主要是HSP70和導致不育癥的多種支原體都有與硫糖脂基團結合專一性，而硫糖脂基團可以有效阻止精卵的結合［11］。但是，也有人認為在不育的動物中HSP70表達的增加可能是在精子凋亡過程中起到一種保護作用。HSP70水平還可能與精液質量相關，如果在精液中加入HSP70抗體，卵母細胞的受精率則呈濃度依賴性降低［13］。

4 熱休克蛋白對魚類生殖細胞的作用機理

魚類在生殖的過程中，首先要產生精子和卵子才能完成受精。研究發(fā)現(xiàn)，魚類的生殖細胞從原始生殖細胞的形成，然后再轉變成卵原細胞和精原細胞，最后在形成成熟的配子過程中細胞都進行了大量的轉錄和分化，同時也伴隨著不同的HSPs的表達［8］。由于它的存在參與了蛋白的折疊、裝配及運輸?shù)然顒?，對調控細胞的生長、存活及分化起著重要作用，因此影響了魚類精子和卵子的形成。有些雌性魚類不育主要是因為HSP60的低水平表達導致了保護水平的較低，使卵細胞無法形成而影響受精過程。在雄魚精子形成的過程中，需要HSPs家族中的一些基因的參與才能完成減數(shù)分裂，如果減數(shù)分裂失敗就會導致精子的凋亡。

4.1 熱休克蛋白在雄性魚生殖中的作用 有學者認為，在雄性魚類精子形成的過程中熱休克蛋白中HSP70對精子的形成有很大的影響作用。但也有人認為，在不育的雄魚中HSP70表達的增加可能是在精子凋亡過程中起到一種保護作用［12］。另外，有研究表明有機磷化合物敵敵畏等可使雄性果蠅的HSP70僅限在睪丸中表達，而那些附屬腺不表達HSP70的雄性果蠅，其睪丸則損傷明顯。HSP70水平還可能與精液質量相關，在炎熱的季節(jié)魚精子HSP70表達較低，精液質量也明顯下降［14］。在精液中如果加入HSP70抗體，卵母細胞的受精率則呈濃度依賴性降低［15］。HSP70抗體可以明顯降低精子與牛卵細胞透明帶結合的能力，也無法完成卵細胞的第2次減數(shù)分裂及原核的形成［16］。

4.2 熱休克蛋白在雌性魚生殖中的作用 無管是正常的還是異常的排卵，雌性魚的輸卵管中亦可檢測到不同的HSPs。排卵后，排卵腔中表達大量的HSP27、HSP60和HSC70。研究表明，雌激素受體與HSP有密切關系，這些HSPs在子排卵腔中表達暗示它們參與了對激素功能的調節(jié)［17］。

HSPs可以保護細胞免受由細胞因子引起的細胞毒性損傷［18］。在子生殖腔中，白細胞可以產生高水平的氧自由基(ROS)和細胞因子，這2種產物可以調節(jié)HSPs的表達［19］。因為白細胞和細胞因子［如腫瘤壞死因子(TNF－A)］在分泌期急劇聚集，此時隨之出現(xiàn)的HSPs可能是保護子排卵膜細胞免于白細胞積聚和細胞因子釋放所造成的細胞損害［18］。當細胞轉染HSP70后，可以保護細胞免于TNF－A引起的毒性損害［17］。此外，HSP70可能可以防止細胞DNA鏈的斷裂，保護線粒體的結構和功能，并由此抑制細胞的凋亡。

5 熱休克蛋白在魚類生殖中存在的問題

綜上所述，作為精子、卵子發(fā)生和成熟過程中關鍵蛋白伴侶分子的HSP，在魚類生殖的過程中扮演者重要的角色。①參與精母細胞和卵母細胞的減數(shù)分裂和轉錄過程;②促進生殖細胞的分化;③改善生殖細胞的質量。根據(jù)HSPs表達方式的不同可以分為2種類型:一類是在應激條件下表達的，另一類是在生理條件下表達的［8］。因此，雖然HSPs在生殖過程中有很重要的作用，但也存在很大的弊端。魚類主要營水生生活，外部環(huán)境對魚的刺激條件很多，含有很多的未知因素，而且不易控制，刺激強度過大或過小都對HSPs的表達和積累有很大的影響，從而可能會導致魚的生殖出現(xiàn)問題。

6 展望

在魚類繁殖的過程中，改善繁殖的技術有很多，而通過控制熱休克蛋白的表達來提高魚類生殖細胞也是一種極其有效的方法。雖然目前人類對這方面的研究還有許多問題尚未解決，但是隨著研究的逐步深入，魚類生殖細胞的發(fā)生、發(fā)育和成熟與熱休克蛋白在不同階段的表達及調節(jié)機制將愈來愈清晰。大量研究表明，母源性基因產物(母源mRNA和蛋白)對魚類生殖細胞的發(fā)生和早期胚胎的發(fā)育的調控起主導作用，而基因產物的蛋白質部分就是熱休克蛋白，環(huán)境變化等非基因因素的調控等因素也對其表達有所影響，但如何控制這些因素仍不清楚。因此，在未來研究魚類繁殖的過程中如何通過外界環(huán)境來控制熱休克蛋白的表達改善魚類生殖細胞和提高魚類產量是值得關注的問題之一。

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