王園園，程英華，劉大松，胡錦華，周鵬

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

牛乳蛋白具有良好的營養(yǎng)和功能特性，被廣泛地應(yīng)用于嬰幼兒乳粉配方中［1-2］。然而人乳和牛乳在組成、含量和功能性等方面有顯著差異［3］。在模擬人體外胃腸液中，人乳酪蛋白變成疏松的絮凝狀，比牛乳形成的凝塊更容易消化吸收［4］。人乳中乳清蛋白和酪蛋白比例為6∶4，其中酪蛋白的主要成分是β-酪蛋白［5］。牛乳中酪蛋白占總蛋白含量的80%左右，分別是 αs1-，αs2-，β-和 κ-酪蛋白，比例約為38%，10%，36%和12%［2］。酪蛋白具有獨特的一級和三級結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄翻譯后在部分絲氨酸殘基上產(chǎn)生了磷酸化共價修飾。與牛乳β-酪蛋白的完全磷酸化(含5個磷酸基團)不同，人乳β-酪蛋白有6種磷酸化水平(含有 0，1，2，3，4 和 5 個磷酸基團)［5］。有研究表明，磷酸基團對酪蛋白的消化、二價陽離子生物利用率，甚至是免疫系統(tǒng)造成的過敏反應(yīng)都有一定的影響［6-7］。所以對牛乳酪蛋白脫磷酸化程度的研究，將有助于模擬人乳酪蛋白的磷酸化水平，提高其功能特性，為嬰幼兒配方乳粉等食品的生產(chǎn)提供更加優(yōu)質(zhì)的原料。

脫磷酸化有化學(xué)和酶學(xué)兩種方法，前者反應(yīng)條件劇烈，容易生成賴丙氨酸等副產(chǎn)物;后者反應(yīng)條件溫和，專一性好，無副反應(yīng)［8］。目前國內(nèi)外有關(guān)蛋白脫磷酸化的研究主要集中在酶的篩選和含磷量的檢測，而酪蛋白磷酸化程度的精確鑒定卻鮮有報道。因此，本研究選用馬鈴薯酸性磷酸酶制備不同脫磷酸化程度的β-酪蛋白和酪蛋白酸鈉樣品，并使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)［9］、尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳(Urea-PAGE)和電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)鑒定磷酸化程度的變化，以便為今后系統(tǒng)研究脫磷酸化修飾的牛乳酪蛋白在嬰幼兒乳粉配方中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯酸性磷酸酶、β-酪蛋白、α-酪蛋白、酪蛋白酸鈉(SC)，Sigma公司;甲酸、乙腈，賽默飛世爾科技(中國)有限公司;丙烯酰胺(Acr)、甲叉丙烯酰胺(Bis)、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-base)、尿素，美國Amresco公司;鹽酸、SDS、甘氨酸、三氯乙酸、甘油、甲醇、冰醋酸、乙醇、過硫酸銨、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)均為分析純。

RC透析膜，上海綠島科技發(fā)展有限公司;HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司;BenchTop Pro冷凍干燥機，美國 VirTis公司;EL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Heraeus Multifuge XIR冷凍離心機，Thermo;ProteanⅡxi Cell電泳儀，美國Bio-rad公司;GelDox XR凝膠成像儀，美國Bio-rad公司;Platform ZMD 4000液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同程度去磷酸化酪蛋白的制備

馬鈴薯酸性磷酸酶溶解于pH 6.80的Tris-HCl緩沖液中，與5 mg/mL的β-酪蛋白或者酪蛋白酸鈉溶液按1∶1比例混合?；旌现罅⒓锤邷販缁?，得到未脫磷的酪蛋白樣品溶液;混合之后37℃水浴反應(yīng)一段時間再高溫滅活，得到部分脫磷的酪蛋白樣品溶液。未脫磷的和部分脫磷的酪蛋白樣品溶液先在4℃透析，然后再冷凍干燥。

1.2.2 SDS-PAGE

濃縮膠和分離膠的濃度分別是4%和12%，將1.2.1的樣品溶液與樣品緩沖液按1∶1的比例混合，加入β-巰基乙醇和0.05%的溴酚藍(lán)，沸水中煮3 min后冰浴冷卻。上樣后濃縮膠和分離膠的電流控制在每塊膠板30 mA和60 mA，4 h后取下膠板染色。染色結(jié)束后用脫色液脫色，每隔1 h更換1次脫色液，至膠板背景變?yōu)闊o色透明。脫色后的膠板用凝膠成像儀拍照，然后保存在脫色液中。

1.2.3 Urea-PAGE

濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為10%，樣品溶液與Urea樣品緩沖液1∶1混合后加入β-巰基乙醇和0.25%的溴酚藍(lán)，混勻備用。每塊膠上樣量為30 μL，濃縮膠和分離膠電壓為280 V和300 V。6 h后取出膠板染色8 h，再用超純水脫色至膠板背景干凈透明。脫色后的膠板用凝膠成像儀拍照，儲存在超純水中。

1.2.4 LC-MS

β-酪蛋白和酪蛋白酸鈉的脫磷酸化程度用超高效液相電噴霧離子化飛行時間質(zhì)譜(UPLC-ESI-TOF MS)鑒定。將蛋白樣品溶于pH8.0的氨水溶液中，10 000 g常溫離心5 min，取上清液過0.45 μm的濾膜，濾液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用鑒定。

色譜條件:選用BEC C4(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司)色譜柱，流動相A液和B液分別是100%的乙腈和0.1%的甲酸，B液從90%到0再降到90%進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件:離子化選用陽離子模式(+ESI)，錐孔電壓40 V，碰撞能量6 eV，質(zhì)荷比(m/z)500～3 000，掃描時間1 s，掃描時間間隔0.02 s。用Mass-Lynx V 4.1和MassEnt 1軟件(Waters)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE鑒定不同程度去磷酸化酪蛋白

β-酪蛋白和酪蛋白酸鈉酶法脫磷酸化修飾前后的SDS-PAGE如圖1所示。與泳道1相比，泳道3中除了β-酪蛋白的條帶外，下端還有其他的條帶，說明β-酪蛋白發(fā)生了水解反應(yīng)，形成小的肽段。從泳道4可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，小的肽段條帶顏色加深，說明β-酪蛋白進(jìn)一步水解，而蛋白水解現(xiàn)象在酪蛋白酸鈉中并不明顯。分析比較泳道5和6發(fā)現(xiàn)，相比標(biāo)準(zhǔn)品，α-和β-酪蛋白的條帶略有下移，但不能區(qū)分修飾后的酪蛋白與未修飾的酪蛋白。在SDSPAGE中，條帶的遷移率主要取決于蛋白的分子量。小分子蛋白通過凝膠孔徑的阻力小，遷移速度快，而大分子蛋白受到較大的阻力，遷移速度慢，因此能與小分子蛋白分離［9］。以β-酪蛋白為例，即使完全脫磷酸基團后，其分子量也只降低400 Da左右，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 β-酪蛋白 24 kDa左右的分子量，因此 SDSPAGE不適合鑒定不同程度酶法脫磷酸化修飾的酪蛋白。

圖1 β-酪蛋白和酪蛋白酸鈉脫磷酸化修飾前后SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE electrophoretic patterns of β-casein and SC before and after dephosphorylation modification

2.2 Urea-PAGE鑒定不同程度去磷酸化酪蛋白

在Urea-PAGE中，尿素作為蛋白質(zhì)變性劑，消除蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵及疏水相互作用，解離肽鏈折疊，與蛋白質(zhì)形成新的復(fù)合物。新的復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率，不再受蛋白質(zhì)分子原來的電荷和形狀的影響，而取決于新復(fù)合物的電荷量、以及分子量的大小。磷酸基團的脫除使酪蛋白分子所帶的凈負(fù)電荷減少，從而等電點增加。β-酪蛋白和酪蛋白酸鈉脫磷酸化程度的不同導(dǎo)致其在相同pH條件下所帶的凈負(fù)電荷不同，利用這一特性，使用U-rea-PAGE鑒定酪蛋白分子酶法脫磷酸化修飾的程度，結(jié)果如圖2所示。從泳道4可以看到4條清晰的條帶，并且遷移率都低于泳道3中的條帶，它們代表了 β-酪蛋白 4 種(0、1、2、3)不同程度的磷酸化水平。脫磷酸化程度與磷酸鹽的終產(chǎn)物抑制有關(guān)，其中磷酸鹽是一種馬鈴薯酸性磷酸酶的競爭性抑制劑;帶有3個磷酸基團的β-酪蛋白可以抵制磷酸酶的作用，這種抵制涉及到分子間相互作用［10］。泳道5中的2個條帶說明酪蛋白酸鈉中β-和α-酪蛋白是完全磷酸化的，而在酶解液中反應(yīng)一段時間后，β-酪蛋白分成了4個條帶，含有 1、2、3、4 個磷酸基團，α-酪蛋白也脫除了部分磷酸基團，形成了多個條帶。因此，Urea-PAGE可以用來初步鑒定酪蛋白的磷酸化程度，能夠較為清楚地分辨出β-酪蛋白的脫磷酸化程度。

圖2 β-酪蛋白和酪蛋白酸鈉脫磷酸化修飾前后Urea-PAGE圖譜Fig.2 Urea-PAGE electrophoretic patterns of β-casein and SC before and after dephosphorylation modification

2.3 LC-MS鑒定不同程度去磷酸化酪蛋白

質(zhì)譜技術(shù)可用來鑒定磷蛋白和含磷肽段中的磷酸基團［11］，當(dāng)采用化學(xué)法脫除絲氨酸殘基上的磷酸基團時，每脫除一個磷酸基團，磷酸絲氨酸殘基的質(zhì)量數(shù)就減少98 kDa(H3PO4)［12］;但是用酶法脫除絲氨酸殘基上的磷酸基團時，只有HPO-3被脫除，保留了完整的絲氨酸殘基，因此質(zhì)量數(shù)減少80 kDa。本實驗使用LC-ESI-MS方法檢測酪蛋白去磷酸化的程度［13］。圖3(a)為β-酪蛋白未脫磷時的去卷積質(zhì)譜圖。未脫磷β-酪蛋白的質(zhì)量數(shù)為23 982.0 Da，與文獻(xiàn)報導(dǎo)值一致，此時蛋白中含有5個磷酸基團［2］。有文獻(xiàn)報道，酪蛋白在沒有添加酶的情況下水浴，可以脫除1個磷酸基團［14］。部分脫磷的β-酪蛋白質(zhì)量數(shù)分布如圖3(b)所示。4種β-酪蛋白的質(zhì)量數(shù)分別是23 823.0 Da、23 741.0 Da、23 662.0 Da 和 23 582 Da，與β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)相比質(zhì)量數(shù)減少了159 Da、241 Da、320 Da和400 Da，表明各脫除了2、3、4和5個磷酸基團。圖3(b)上23 741.0 Da和23 662 Da處的兩個峰信號最強，說明此時β-酪蛋白主要脫除了3個和4個磷酸基團，與圖2中泳道4脫磷酸化β-酪蛋白的條帶分布結(jié)果一致。

圖3 β-酪蛋白脫磷酸化修飾去卷積質(zhì)譜圖Fig.3 Deconvoluted mass spectrum of β-casein after dephosphorylation modification

圖4是酪蛋白酸鈉中β-酪蛋白的去卷積質(zhì)譜圖。對于未脫磷的樣品，β-酪蛋白的質(zhì)量數(shù)為23 983.0 Da，有5個磷酸基團。圖4(b)反映了部分脫磷后β-酪蛋白分子質(zhì)量的變化，從23 983.0 Da變?yōu)?3 903.0 Da、23 823.0 Da、23 743.0 Da 和 23 662.0 Da，減少了 80 Da、160 Da、240 Da 和 321 Da，分別脫除了1、2、3和4個磷酸基團，與Urea-PAGE中脫磷酸化β-酪蛋白的條帶分布結(jié)果一致。

圖4 酪蛋白酸鈉中β-酪蛋白脫磷酸化修飾去卷積質(zhì)譜圖Fig.4 Deconvoluted mass spectrum of β-casein in sodium caseinate after dephosphorylation modification

圖5 酪蛋白酸鈉中α-酪蛋白脫磷酸化修飾去卷積質(zhì)譜圖Fig.5 Deconvoluted mass spectrum of α-casein in sodium caseinate after dephosphorylation modification

從圖5(a)可以看出，酪蛋白酸鈉中α-酪蛋白的質(zhì)量數(shù)為23 612.0 Da，與Léonil等檢測到的值(23 614 Da)吻合，此時 α-酪蛋白含有 8個磷酸基團［14］。部分脫磷的樣品中，α-酪蛋白的質(zhì)量數(shù)如圖5(b)所示，分別為 23 452.0 Da、23 372.0 Da、23 292.0 Da 和23 214.0 Da，含有6個、5個、4個和3個磷酸基團。LC-MS不僅可以鑒定純β-酪蛋白的磷酸化程度，還可以區(qū)分混合體系中各種蛋白的磷酸化程度的變化，如酪蛋白酸鈉中的β-和α-酪蛋白。

3 結(jié)論

β-酪蛋白的分子質(zhì)量為23982 Da，含有5個磷酸基團，在馬鈴薯酸性磷酸酶的作用下，對于部分脫磷酸化的樣品，脫除了2、3、4、5個磷酸基團。對于酪蛋白酸鈉，其部分脫磷酸化的樣品中，β-酪蛋白脫除了1、2、3、4 個磷酸基團，而 α-酪蛋白脫除了 2、3、4、5 個磷酸基團。另外，β-酪蛋白在去磷酸化修飾的同時也發(fā)生了水解反應(yīng)，而酪蛋白酸鈉不易水解。

SDS-PGAE可以辨別分子質(zhì)量相差較大的蛋白，觀察蛋白是否發(fā)生降解，但是不適用脫磷酸化程度的研究。Urea-PAGE可以鑒定酪蛋白磷酸化程度的變化，尤其是β-酪蛋白，檢測結(jié)果較為清晰。LC-MS得到的去卷積質(zhì)譜圖直觀地反應(yīng)了單一或混合體系中不同脫磷酸化程度酪蛋白的分子量分布，定性和定量分析酪蛋白中磷酸基團的變化。

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