余孔捷，林永輝，劉正才，黃杰，陳旭東，王丹紅，盧聲宇

(福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州，350001)

硝基呋喃類藥物及其代謝物具有很大的毒性和副作用，能誘導(dǎo)有機(jī)體基因突變，有致畸胎，誘發(fā)癌癥風(fēng)險(xiǎn)［1］，我國(guó)及歐盟等國(guó)家和地區(qū)禁用硝基呋喃類藥物于食用動(dòng)物，要求在動(dòng)物源性食品中不得檢出該類殘留物［2-3］。在動(dòng)物體內(nèi)，硝基呋喃類藥物代謝快，但其代謝物則會(huì)存留較長(zhǎng)時(shí)間，因而代謝物作為該類藥物的標(biāo)記殘留物。硝基呋喃類藥物殘留是我國(guó)出口水產(chǎn)品等較高頻次檢測(cè)項(xiàng)目之一，也是國(guó)內(nèi)重點(diǎn)監(jiān)控的指標(biāo)。為保證水產(chǎn)品中藥物殘留檢測(cè)的工作質(zhì)量，需要含目標(biāo)殘留物自然基體質(zhì)控標(biāo)樣。文中涉及的AOZ是硝基呋喃類藥物之一的呋喃唑酮的代謝物(3-氨基-2-唑酮)。理想的的質(zhì)控樣應(yīng)是外觀狀態(tài)(如非凍干粉)和內(nèi)在結(jié)合狀態(tài)(如均為體內(nèi)代謝自然結(jié)合)都與實(shí)際檢測(cè)樣品一致的自然基體樣品，以保證二者在分析中的操作步驟和提取效率都能一致［4］。余孔捷等曾報(bào)道在野外養(yǎng)殖池中藥浴方法獲得陽(yáng)性材料制備含AOZ蝦肉糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品(RM)［5］，但涉及野外作業(yè)成本高耗時(shí)長(zhǎng)多有不便。本文在其基礎(chǔ)上建立了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)藥浴活蝦快速獲取合適含量水平的自然基體陽(yáng)性材料方法，并制備了多含量水平自然基體質(zhì)控樣品用于主持實(shí)施國(guó)家認(rèn)監(jiān)委(CNCA)的“水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物(AOZ)檢測(cè)能力驗(yàn)證”計(jì)劃項(xiàng)目。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

南美白對(duì)蝦(Penaeusvanammi)，采用市售活蝦，每500g約55尾，經(jīng)LC-MSMS檢測(cè)無(wú)AOZ殘留;市售醫(yī)用呋喃唑酮片，經(jīng)HPLC檢測(cè)呋喃唑酮含量為6%;藥浴用水為自來(lái)水。

攪拌型勻漿機(jī)，丹麥FOSS 2094型;拍擊均質(zhì)器，Stomacher 3500型，英國(guó) Seward;真空包裝機(jī)，SC-300A型，安溪縣三和茶葉機(jī)械廠;Co60-γ射線輻照裝置，設(shè)計(jì)容量1.85×1016Bq，福建省康普頓輻照技術(shù)有限公司;冰柜，BC/BD-718A，青島海爾特種電冰柜有限公司;藥浴實(shí)驗(yàn)用空氣泵，漁亭牌ACO-002型，浙江森森實(shí)業(yè)有限公司;藥浴實(shí)驗(yàn)池，市售塑料方桶，下部外徑約67 cm×46 cm，高61 cm。

1.2 活蝦藥浴

準(zhǔn)備好潔凈的B、C 2個(gè)藥浴實(shí)驗(yàn)池(空桶)，加注自來(lái)水約40 cm深。分別稱取研成粉末的含量為6%的呋喃唑酮藥末28 mg和46 mg各1份，各加水約100 mL，混勻，分別轉(zhuǎn)移至B、C池中，攪勻。此時(shí)，池中藥浴液含呋喃唑酮初始濃度分別約為B池13.6 ng/L、C池22.4 ng/L。各5 kg無(wú)呋喃唑酮污染活蝦直接轉(zhuǎn)移B、C池中，并開(kāi)始計(jì)時(shí)。藥浴時(shí)，用空氣泵接乳膠管不間斷向藥浴液中增氧。放置藥浴池的室內(nèi)有空調(diào)調(diào)節(jié)室內(nèi)基本保持20℃。藥浴5 h后，撈起藥蝦(記為B蝦、C蝦)。

1.3 藥蝦及陽(yáng)性材料的處理

B蝦、C蝦分別按下述步驟處理:經(jīng)冷凍處死后去頭剝殼取肉，-20℃冷凍保存。將冷凍狀態(tài)蝦肉樣本轉(zhuǎn)移至4℃冰箱解凍后置于勻漿機(jī)中，充分勻漿。混合所有樣漿。然后，取適量裝入拍擊袋后置于拍擊式均質(zhì)器中，按180拍/min的頻率，每次拍擊2 min后取下揉混袋中漿樣，再拍擊，如此反復(fù)拍擊3次。拍擊后漿樣混合于大桶中，再次人工混勻。取糜樣每份約25 g裝入PE膜內(nèi)袋，再套上PA/CPP耐蒸煮復(fù)合膜外袋。用真空封口機(jī)對(duì)裝好糜樣的外袋熱封口。貼上帶編號(hào)的樣品標(biāo)簽。將裝袋、封口、上簽的樣品送福建省康普頓輻照技術(shù)有限公司進(jìn)行輻照滅菌，輻照劑量為12 kGy。滅菌后樣本置于-20℃冰箱中貯存。

1.4 均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)

各濃度水平樣品分別隨機(jī)抽取10份，每個(gè)樣品重復(fù)條件下測(cè)定2次。采用單因子方差分析法(F檢驗(yàn)法)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

進(jìn)行了6個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的共6次穩(wěn)定性檢驗(yàn)，日期分別為5月11日、5月26日、5月28日、6月15日、7月18日、8月5日。在這些日期隨機(jī)抽取B、C 2個(gè)水平樣品各6份。檢測(cè)方法、檢測(cè)人員、儀器、實(shí)驗(yàn)室與均勻性檢測(cè)相同。采用t檢驗(yàn)法評(píng)定樣品穩(wěn)定性。

1.5 實(shí)施全國(guó)能力驗(yàn)證后獲得的中位值

用上述獲得的樣品成功實(shí)施國(guó)家認(rèn)監(jiān)委的全國(guó)性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證［6］，B樣、C樣各有34家檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室參加，中位值分別為 4.20、6.74 μg/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥浴時(shí)間的選擇及藥浴與預(yù)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)野外蝦池藥浴實(shí)驗(yàn)結(jié)果(參考文獻(xiàn)［5］之圖1)，藥浴后蝦體內(nèi)AOZ含量變化相對(duì)平穩(wěn)的有峰值前后、藥后9～24 h和30 h后3個(gè)時(shí)間段，這3個(gè)時(shí)間段較適宜撈蝦，以減少個(gè)體間含量差異?？紤]到盡量節(jié)省藥浴時(shí)間，也由于在室內(nèi)條件下高密度藥浴不宜長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行，以減少活蝦死亡率，本文室內(nèi)藥浴實(shí)驗(yàn)選擇了峰值附近的5h結(jié)束藥浴并撈蝦。

相同藥浴時(shí)間不同的藥浴液初始濃度的藥后蝦體應(yīng)有不同的AOZ含量，為了解本實(shí)驗(yàn)條件下藥后蝦體中AOZ含量與藥浴液初始濃度(x)的關(guān)系，采用藥浴液初始濃度(35.6 ng/L，單濃度水平)進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)所得蝦糜AOZ含量(y)經(jīng)檢測(cè)為13.5 μg/kg。則在本實(shí)驗(yàn)條件下有y=0.38x。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)假設(shè)輻照滅菌后AOZ含量(yi)約有15%的損失率，即輻照后AOZ含量yi=0.85y，則yi=0.32x。

2.2 獲取陽(yáng)性材料的藥浴

按yi=0.32x估測(cè)藥浴液初始濃度x。期望獲得4.4、7.2 μg/kg 的 yi，選擇藥浴液初始濃度 x 分別為為13.6 ng/L(xB)和22.4 ng/L(xC)。藥浴后所得藥蝦AOZ含量檢測(cè)結(jié)果分別為B蝦4.61 μg/kg、C蝦7.05 μg/kg。與預(yù)期值差別不大。而輻照滅菌效果和考察阻隔性包裝效果在參考文獻(xiàn)［6］中已得驗(yàn)證，此不贅述。

2.3 均勻性穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

均勻性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。查臨界值F0.05(9，10)=3.02。表2計(jì)算各樣品的F值均小于臨界值，表明在0.05顯著性水平時(shí)，樣品間和樣品內(nèi)無(wú)顯著性差異。

表1 均勻性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 The statistical results of homogeneity test

穩(wěn)定性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。表2中參考值系均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)。查t雙尾臨界=2.14，表3計(jì)算所得t值均小于t雙尾臨界值。表明樣品是穩(wěn)定的。

表2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 The statistical results of stability test

2.4 實(shí)施全國(guó)能力驗(yàn)證后獲得的中位值

應(yīng)用所得陽(yáng)性樣品成功實(shí)施了全國(guó)性實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證，該能力驗(yàn)證共提供A、B、C 3個(gè)含量水平的測(cè)試樣，其中B、C 2個(gè)含量水平樣品即本文所得B樣、C樣(A樣則系本實(shí)驗(yàn)室原有留存質(zhì)控樣，每個(gè)參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)其中兩個(gè)水平樣品)。檢測(cè)B樣、C樣的實(shí)驗(yàn)室各有34家，經(jīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)B樣、C樣中位值分別為4.20、6.74μg/kg。比較中位值與預(yù)期值，B樣、C樣的相對(duì)相差分別為-4.5%和-6.4%，均可接受。B樣、C樣的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果相關(guān)統(tǒng)計(jì)參數(shù)見(jiàn)表3。B樣、C樣品中位值作為指定值，實(shí)施了參加能力驗(yàn)證結(jié)果可疑和離群實(shí)驗(yàn)室的后續(xù)補(bǔ)測(cè)(測(cè)量審核)活動(dòng)。4家實(shí)驗(yàn)室參加B樣補(bǔ)測(cè)，9家實(shí)驗(yàn)室參加C樣補(bǔ)測(cè)，結(jié)果除B樣結(jié)果可疑外，其他結(jié)果均滿意。

表3 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的統(tǒng)計(jì)匯總Table 3 Statistical parameters of laboratory test result

3 結(jié)論

本文建立的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)快速獲取含AOZ蝦糜自然基體陽(yáng)性材料的方法，無(wú)需野外作業(yè)，簡(jiǎn)便省時(shí)。經(jīng)用于實(shí)施全國(guó)性能力驗(yàn)證實(shí)踐，所制質(zhì)控樣品均勻穩(wěn)定，同時(shí)保證了外觀狀態(tài)(非凍干粉)和內(nèi)在結(jié)合狀態(tài)(體內(nèi)代謝自然結(jié)合)都與日常檢測(cè)樣品一致，以免導(dǎo)致二者在分析中的操作步驟和提取效率的可能不一致。

［1］ 彭濤，儲(chǔ)小剛，楊強(qiáng)，等.高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中的硝基呋喃代謝物［J］.分析化學(xué)，2005，33(8):1073-1076.

［2］ Comission Regulation(EC)No1442/95.of 26 June 1995 amending AnnexesⅠ，Ⅱ，Ⅲ andⅣ of Council Regulation(EEC)No 2377/90 laying down a community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin［S］.

［3］ 農(nóng)業(yè)部193號(hào)公告-2002.食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單［S］.

［4］ Gowik P，Polzer J，Uhlig S.Reference material in residue control:assessment of matrix effects［J］.Accreditation and Quality Assurance，2007，12(3/4):161-166.

［5］ 余孔捷，劉正才，楊方，等.AOZ殘留分析質(zhì)控用蝦糜自然(污染)基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制［J］.分析試驗(yàn)室，2010，29(3):50.