桑葦，唐柯，徐巖，王棟，李記明

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇無錫，214122)

2(煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?，山東煙臺(tái)，264000)

香氣是葡萄酒的重要感官指標(biāo)，對(duì)葡萄酒的風(fēng)格和品質(zhì)有重要的影響［1］。葡萄酒香氣根據(jù)來源不同分為品種香、發(fā)酵香和陳釀香［2］。葡萄酒中的香氣成分主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)香氣前體物質(zhì)的形式存在，結(jié)合態(tài)物質(zhì)本身沒有香氣，必須經(jīng)過分解釋放才能產(chǎn)生香氣。通常葡萄漿果中以葡萄糖苷鍵形式存在的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量比游離態(tài)的呈香物質(zhì)要豐富，如單萜烯基-β-葡萄糖苷、以S-半胱氨酸形式存在的硫醇等，這些風(fēng)味前體物質(zhì)的含量遠(yuǎn)多于揮發(fā)性的萜烯化合物［3-4］。由于結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)本身沒有香氣且不揮發(fā)或難揮發(fā)［5］，為使這些香氣分子釋放，就需要打斷結(jié)合香氣分子的糖苷鍵，從而釋放出具有濃郁香氣且易揮發(fā)的糖苷配基。糖苷配基主要包括萜烯類化合物、脂肪醇類、芳香烴類衍生物等，β-葡萄糖苷酶則是這些香氣分子釋放過程酶系中最重要的酶之一［6-8］。

β-葡萄糖苷酶是芳香前體水解、結(jié)合態(tài)糖苷配基釋放的關(guān)鍵酶［9］。1837年Liebig 和 W?hler［10］在苦杏仁汁中首次發(fā)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶。González Pombo［11］、Pardo García［12］等用 β-葡萄糖苷酶水解酶系處理麝香(Muscat)葡萄酒，GC-MS分析結(jié)果表明，經(jīng)酶處理后葡萄酒的香氣成分芳樟醇、香葉醇、α-松油醇、芳樟醇氧化物等含量明顯提高。Baffi［13］等人篩選出產(chǎn)自出芽短梗霉的β-葡萄糖苷酶，對(duì)葡萄酒加酶處理后單萜類物質(zhì)含量亦有顯著提升。郭慧女［14］等研究了黑曲霉β-葡萄糖苷酶對(duì)麝香葡萄酒中結(jié)合態(tài)香氣提取物質(zhì)的酶解作用效果，水解斷裂產(chǎn)生典型的萜烯、醇類、酯類等化合物，釋放出令人愉快的香氣物質(zhì)。

β-葡萄糖苷酶是風(fēng)味修飾中的關(guān)鍵酶，對(duì)葡萄酒香氣的提升具有十分重要的作用，但由于我國葡萄酒工業(yè)起步較晚，目前葡萄酒用商業(yè)酶制劑基本都為國外所壟斷。本課題組在前期研究中從葡萄園環(huán)境中篩選得到1株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的黑曲霉(Aspergillus niger)，且酶具有較好的應(yīng)用特性［14］。本研究則利用這株黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，采用Kramer感官評(píng)定的方法研究β-葡萄糖苷酶對(duì)赤霞珠葡萄新酒酶解增香調(diào)控的最佳條件，并采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(SPME-GC-MS)分析酶解處理對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的影響，旨在為風(fēng)味酶的國產(chǎn)化應(yīng)用以及葡萄酒的工業(yè)化酶解增香提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠干紅葡萄酒，2013年產(chǎn)，張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，電泳純級(jí)別;無水NaCl，分析純，上海國藥集團(tuán);內(nèi)標(biāo)物2-辛醇(2-Octanol)，色譜純，Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GC 6890N-MSD 5975，美國Agilent公司;DB-FFTP色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國J＆W公司;Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄酒酶解反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

經(jīng)單因素酶解實(shí)驗(yàn)，選擇合適的酶解溫度、酶解時(shí)間及加酶量3個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)［15］，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1、表2所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test

表2 正交實(shí)驗(yàn)樣品編號(hào)Table 2 Sample number of the orthogonal test

1.3.2 Kramer感官順位評(píng)定

15名經(jīng)過1年以上感官品評(píng)培訓(xùn)的品評(píng)員，在室內(nèi)溫度適宜，陽光充足條件下，對(duì)已隨機(jī)編號(hào)的正交實(shí)驗(yàn)酶解處理的9個(gè)樣品及空白對(duì)照樣品(J)進(jìn)行聞香，并按照香氣濃度強(qiáng)弱程度進(jìn)行打分排序。

利用SPSS Statistics 19.0軟件Duncan多重比較方法處理Kramer感官品評(píng)數(shù)據(jù)［16］，得到實(shí)驗(yàn)條件下β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄酒酶解增香調(diào)控的最佳條件。

1.3.3 HS-SPME分析條件

在最佳條件酶解反應(yīng)后，樣品待HS-SPME分析。

頂空固相微萃取條件:45℃預(yù)熱2.5 min，萃取吸附45 min，GC解析5 min，用于GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS 分析條件［17］

GC條件:樣品經(jīng)DB-FFTP色譜柱分離;進(jìn)樣口溫度250℃，不分流;載氣為He，流速2 mL/min;柱溫升溫程序:初始溫度50℃，穩(wěn)定2 min后，以4℃/min速率升溫至230℃，保持15 min。分離后的樣品經(jīng)過MSD5975檢測(cè)。

MS條件:EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度為230℃，掃描范圍30.00～500.00 amu。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次求取平均值。

1.3.5 物質(zhì)定性與半定量方法

物質(zhì)定性:香氣活性成分的定性通過與NIST 05質(zhì)譜庫(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行檢索比對(duì)，并根據(jù)改進(jìn)的Kovats［18］法計(jì)算得到各物質(zhì)保留指數(shù)(RI)進(jìn)行確認(rèn)。

組分峰面積的相對(duì)含量:在待測(cè)酒樣中加入2-辛醇(2-Octanol)內(nèi)標(biāo)，進(jìn)GC-MS分離。計(jì)算公式為:

其中Xi為待測(cè)物質(zhì)相對(duì)含量;Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)濃度;Ai為待測(cè)物質(zhì)峰面積;As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 Kramer感官順位評(píng)定結(jié)果及分析

酒樣按照正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中的條件處理結(jié)束后，進(jìn)行Kramer感官品評(píng)。在進(jìn)行感官品評(píng)時(shí)，品評(píng)員得到隨機(jī)排序編號(hào)的樣品后，按照香氣強(qiáng)弱程度將樣品先大致分為強(qiáng)、中、弱3組，再在3組組內(nèi)進(jìn)行比較排序，確定所有樣品香氣強(qiáng)弱順序，最終所有樣品按照香氣由弱到強(qiáng)進(jìn)行排列。對(duì)于不同樣品，如無法區(qū)別時(shí)，在評(píng)價(jià)時(shí)注明相同位級(jí)。

15名感官品評(píng)員對(duì)10個(gè)葡萄酒樣品的香氣強(qiáng)弱程度進(jìn)行Kramer感官評(píng)定，結(jié)果如表3所示。由表3中看出，15名品評(píng)員對(duì)10個(gè)葡萄酒樣品進(jìn)行較好排序，無相同位級(jí)。

表3 Kramer感官順位評(píng)定結(jié)果(香氣由弱到強(qiáng))排序Table 3 Kramer sensory evaluation result(weak to strong)

利用SPSS Statistics 19.0軟件Duncan多重比較方法處理Kramer感官品評(píng)數(shù)據(jù)，得到表4。依據(jù)品評(píng)員數(shù) n=15，樣品數(shù) m=10，查表［19］，得到顯著性水平臨界值。α=0.01顯著水平:上段為49～116，下段為57～108。由表4中 Rmax=RE=123＞116，Rmin=RJ=41＜49，15名品評(píng)員排序有效，在P=0.01具有顯著性差異。10個(gè)樣品依顯著性劃分為3組:樣品A、J樣品為一組，樣品 B、C、D、F、H、I為一組，樣品E、G為一組，且組內(nèi)無顯著差異。

表4 10個(gè)葡萄酒樣品位級(jí)及位級(jí)和Table 4 Rank and rank sum of ten samples

2.2 酶解增香最佳條件的確定

根據(jù)Kramer感官順位評(píng)定得到樣品的位級(jí)和，對(duì)赤霞珠葡萄酒酶解增香的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表5所示。

表5 正交實(shí)驗(yàn)極差分析Table 5 Experiment result of orthogonal design and range analysis

比較表5中的極差差異，可知影響葡萄酒酶解增香3個(gè)因素的主次順序?yàn)槊附鉁囟?、加酶量、酶解時(shí)間。其中酶解溫度為主要影響因素，可見酶的活性與作用環(huán)境溫度相關(guān)性較大，加酶量次之。綜合正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果，可得3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的最優(yōu)組合為A2B2C3，即在酶解溫度45℃、酶解時(shí)間4.0 h、加酶量4.0 U/mL條件下處理的葡萄酒。

2.3 酶解處理對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒香氣物質(zhì)的影響

依據(jù)酶解增香調(diào)控的優(yōu)化條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果，處理赤霞珠干紅葡萄酒，研究酶解處理對(duì)赤霞珠葡萄新酒香氣物質(zhì)的影響。對(duì)酶解前后樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性及組分峰面積的相對(duì)含量比較，數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表6所示。

對(duì)添加黑曲霉β-葡萄糖苷酶實(shí)驗(yàn)前后的酒樣經(jīng)GC-MS檢測(cè)分析，共定性得到59種呈香物質(zhì)。單因素方差分析結(jié)果表明，共35種物質(zhì)在處理前后具有顯著性差異(P＜0.05)，其中23種物質(zhì)具有極顯著差異(P＜0.01)。酶解處理后香氣物質(zhì)相對(duì)總量與對(duì)照相比增加24.59%，其中萜烯及C13-降異戊二烯類物質(zhì)相對(duì)含量增加118.54%，醇類物質(zhì)相對(duì)含量增加19.12%，芳香族類化合物相對(duì)含量增加17.24%，酯類物質(zhì)相對(duì)含量增加16.04%，這4類物質(zhì)相對(duì)含量占總含量的94.64%。

在所有香氣物質(zhì)中，萜烯及C13-降異戊二烯類物質(zhì)相對(duì)含量增加最為明顯突出，且都具有顯著性差異。萜烯及C13-降異戊二烯類物質(zhì)是形成和決定葡萄酒品種香氣關(guān)鍵的因素，通常都具有濃郁的香氣及較低的感官閾值［20］，是釀酒葡萄原料中潛在的非常重要的香氣成分，對(duì)葡萄酒品質(zhì)起著舉足輕重的作用［21］。萜烯類化合物多以無味的糖苷態(tài)形式存在，通過外源添加糖苷酶則是釋放游離態(tài)萜烯化合物的有效方法。從表6可以看出，經(jīng)酶解后的葡萄酒樣品，萜烯類物質(zhì)相對(duì)含量均有明顯提升。含量增加最多的是4-萜品醇，其相對(duì)含量增加682%，可以釋放松節(jié)油、核仁等香氣;其次是α-松油醇，其相對(duì)含量增加239%，具有茴香，薄荷的香氣特征;香葉醇相對(duì)含量增加205%，能夠釋放玫瑰花、天竺葵香氣;香葉基丙酮相對(duì)含量增加150%，具有木蘭花香;β-紫羅蘭酮相對(duì)含量增加113%，表現(xiàn)出紫羅蘭花香的香氣特征;香葉醛相對(duì)含量增加51%，具有薄荷，檸檬等香氣;β-大馬酮相對(duì)含量增加43%，能夠釋放濃郁的蜂蜜香氣。本實(shí)驗(yàn)與Baffi［13］研究來源于出芽短梗霉的β-葡萄糖苷酶作用結(jié)果相比，更多地釋放了4-萜品醇、β-紫羅蘭酮、β-大馬酮等香氣物質(zhì)。萜烯類香氣的釋放，也使葡萄酒品種香更加馥郁豐富。

由以上結(jié)果可知，來源于黑曲霉β-葡萄糖苷酶對(duì)結(jié)合態(tài)萜烯類物質(zhì)具有很強(qiáng)的作用效果，有效地水解結(jié)合態(tài)前體物質(zhì)糖苷鍵，促使糖苷配基及香氣小分子的釋放，對(duì)提高葡萄酒中典型性香氣，建立葡萄酒獨(dú)特風(fēng)格起到積極影響。

表6 糖苷酶處理前后對(duì)比結(jié)果及顯著性分析Table 6 One-way analysis of variance of aroma compounds content before and after β-glucosidase processing

續(xù)表6

3 結(jié)論

本研究采用黑曲霉β-葡萄糖苷酶，研究其對(duì)葡萄酒增香調(diào)控最佳條件及酶解對(duì)香氣物質(zhì)的影響。采用Kramer感官品評(píng)的方法，確定了β-葡萄糖苷酶酶解增香調(diào)控的最佳條件為酶解溫度45℃、酶解時(shí)間4.0 h、加酶量4.0 U/mL。對(duì)添加黑曲霉 β-葡萄糖苷酶實(shí)驗(yàn)前后的酒樣經(jīng)GC-MS檢測(cè)分析，共定性得到59種呈香物質(zhì)。方差分析結(jié)果表明有35種物質(zhì)在處理前后具有顯著差異(P＜0.05)，其中23種物質(zhì)具有極顯著差異(P＜0.01)。β-葡萄糖苷酶對(duì)結(jié)合態(tài)萜烯類物質(zhì)具有良好的水解作用，這些物質(zhì)含量的增加對(duì)葡萄酒風(fēng)味改變都起到積極作用和影響。

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