王宗春，劉 紅(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060;湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

醋酸洗必泰為消毒防腐藥，通過吸附在細菌胞漿膜使細胞內(nèi)容物漏出而起到抑菌和殺菌作用，對葡萄球菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、白色念珠菌、大腸桿菌、厭氧丙酸菌等呈高度敏感，《湖北省醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》［1］收載了該藥物的洗劑。為了擴大醋酸洗必泰的臨床用途，本文配制了其沖洗劑，以用于皮膚及黏膜的消毒、創(chuàng)面感染、陰道感染和子宮頸糜爛的沖洗，并考察了其質(zhì)量控制方法，重點對鱟試劑方法用于其細菌內(nèi)毒素檢查的可行性進行研究，報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2201型紫外分光光度計(日本島津);TG328A型電子分析天平(上海天平儀器廠);PHS-25C型數(shù)顯酸度計(上海越磁電子科技有限公司);SW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);微量移液器(100-1 000 μl)(賽黙飛世爾科技有限公司);恒溫水浴箱(上海卓爵儀器設(shè)備有限公司);細菌內(nèi)毒素檢查用具(湛江安度斯生物有限公司)。

1.2 藥品與試劑

醋酸洗必泰(錦州九泰藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號120901);細菌內(nèi)毒素工作標準品(中國食品藥品檢定研究院，每支10 EU，批號2012-10);鱟試劑(TAL，廈門鱟試劑實驗廠，規(guī)格 0.10 ml，批號121007，靈敏度0.50 EU/ml);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格0.10 ml，批號121226，靈敏度0.50 EU/ml);細菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，廈門鱟試劑實驗廠，每支2 ml，批號121018)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方與配制工藝

2.1.1 處方 參照《湖北省醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》2011年版醋酸洗必泰洗劑制備方法，處方為醋酸洗必泰 0.50 g，注射用水加至 1 000 ml。

2.1.2 配制工藝 稱取醋酸洗必泰0.50 g，溶解于約800 ml熱注射用水中，加入0.20%(W/V)活性碳，加熱煮沸20 min，冷卻至50℃左右，濾過脫碳，自濾器上添加注射用水至1 000 ml，攪拌均勻，灌裝于100 ml玻璃瓶，軋蓋，流通蒸汽滅菌100℃，30 min，檢查，貼簽，即得。共配制3批，批號分別為20130105、20130114、20130121。

2.2 一般質(zhì)量控制

2.2.1 性狀 本品為無色的澄明溶液，味苦。

2.2.2 醋酸洗必泰鑒別 方法一:取本品5 ml，加重鉻酸鉀試液1滴，產(chǎn)生黃色沉淀，加稀硝酸數(shù)滴，沉淀即溶解;方法二:取本品5 ml，加硫酸銅試液2滴，加熱，產(chǎn)生淡紫色的絮狀物。

2.2.3 檢查 符合沖洗劑項下有關(guān)的各項規(guī)定。

2.2.4 含量測定 參照《湖北省醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》2011年版醋酸洗必泰洗劑含量測定方法，精密量取本品2 ml，置100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，照分光光度法(《中國藥典》2010年版二部附錄ⅣA)，在254 nm波長處測定吸收度，按 C22H30C2N10·2C2H4O2的吸收系數(shù)(E1%1 cm)為447計算，3批樣品的含量測定結(jié)果分別為 0.50 mg/ml，0.49 mg/ml，0.50 mg/ml，均在標示量(0.50 mg/ml)的 95.0%-105.0%范圍內(nèi)，含量檢測合格。

2.3 細菌內(nèi)毒素檢查的可行性研究

2.3.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核 按照細菌內(nèi)毒素檢查法鱟試劑靈敏度復(fù)核項對2批鱟試劑的標示靈敏度進行復(fù)核［2］，2批鱟試劑靈敏度的測定值 λc均在0.5λ -2.0λ(λ 為靈敏度標示值)范圍之內(nèi)，靈敏度符合規(guī)定，可用于實驗，結(jié)果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Table 1 The sensitivity test results of tachypleus amebocyte lysate

2.3.2 細菌內(nèi)毒素限值(L)的確定 中國藥典2010年版二部附錄ⅠS(洗劑，沖洗劑，灌腸劑)規(guī)定每1 ml沖洗劑中含細菌內(nèi)毒素應(yīng)小于0.50 EU，即醋酸洗必泰沖洗劑的細菌內(nèi)毒素限值(L)為0.50 EU/ml。

2.3.3 樣品最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的確定 樣品最大有效稀釋倍數(shù)MVD=L/λ，其中λ為鱟試劑靈敏度，L為細菌內(nèi)毒素限值(0.50 EU/ml)，目前市售鱟試劑的靈敏度 λ 常為 0.50，0.25，0.125，0.06，0.03 EU/ml，對應(yīng)的樣品 MVD 為 1(原液)，2，4，8，16。

2.3.4 干擾預(yù)試驗 為了初步評價樣品濃度對鱟試劑與細菌內(nèi)毒素之間凝集反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì)，以便篩選出對檢查無干擾的樣品濃度范圍及相應(yīng)的鱟試劑靈敏度，避免鱟試劑的浪費，選擇批號為20130105的樣品進行干擾預(yù)試驗。用BET水稀釋醋酸洗必泰沖洗劑至1(原液)，2，4，8，16倍的溶液，用酸度計測定pH值，均在6.30-6.60范圍內(nèi)，符合細菌內(nèi)毒素檢查的pH值要求，不需要調(diào)節(jié)pH值，記為供試品陰性對照(NPC)系列。同時配制含有1.0 EU/ml(2λ)細菌內(nèi)毒素的上述稀釋倍數(shù)系列溶液，記為供試品陽性對照(PPC)系列［3，4］。

取靈敏度為0.5 EU/ml的兩個廠家的鱟試劑與上述NPC和PPC系列溶液進行反應(yīng)，每一稀釋倍數(shù)重復(fù)兩管，設(shè)立陽性對照(PC)和陰性對照(NC)。

結(jié)果顯示質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml及以下的醋酸洗必泰沖洗液對鱟試劑與細菌內(nèi)毒素之間的凝集反應(yīng)既無增強作用，也無抑制作用。

2.3.5 正式干擾試驗 根據(jù)干擾預(yù)試驗結(jié)果，可以直接選擇3個批號的樣品原液，用λ為0.50 EU/ml的鱟試劑進行以下正式干擾試驗。用供試品原液及BET水分別配制細菌內(nèi)毒素最終濃度為1.00，0.50，0.25，0.125 EU/ml的系列溶液，取 0.10 ml加入到已復(fù)溶的兩個不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑(靈敏度λ為0.50 EU/ml)管內(nèi)，每個濃度平行做4管，另取供試品溶液做2支陰性對照管，進行干擾確證試驗［5，6］。

表2 結(jié)果顯示，Et/Es在0.5-2之間(Es為用BET水制成的細菌內(nèi)毒素標準溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標準溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值)，按照中國藥典2010年版(二部)判斷標準，供試品原液對鱟試劑與細菌內(nèi)毒素之間的凝集反應(yīng)無干擾作用，可以使用鱟試劑方法檢查醋酸洗必泰沖洗劑中細菌內(nèi)毒素，即細菌內(nèi)毒素檢查法適用于本品，無需進行熱原檢查［7］。

表2 醋酸洗必泰沖洗劑干擾試驗結(jié)果Table 2 Interference test results of chlorhexidine acetate irrigation solution

2.4 穩(wěn)定性考察

將樣品(批號:20130105)在室溫條件下放置12個月，并分別于 1，3，6，9，12 月取樣，考察沖洗劑的外觀、含量變化，重點進行細菌內(nèi)毒素限度檢查，并與0月結(jié)果進行比較。表3結(jié)果顯示，在室溫留樣條件下放置12個月，醋酸洗必泰沖洗劑的各項考察指標均無明顯變化，表明醋酸洗必泰沖洗劑穩(wěn)定性良好。

表3 醋酸洗必泰沖洗劑室溫留樣考察結(jié)果Table 3 Storage stability of chlorhexidine acetate irrigation solution at room temperature

3 討論

由于醋酸洗必泰沖洗劑臨床主要用于各種創(chuàng)傷、滲出、糜爛的開放性感染性皮膚病及傷口沖洗，在配制過程中應(yīng)嚴格按照無菌操作規(guī)程，對各種可能污染熱原的途徑進行嚴格控制，并通過加入活性碳煮沸30 min吸附熱原。

在質(zhì)量控制方面，考慮到?jīng)_洗劑用量大，并且用于創(chuàng)面的沖冼，中國藥典2010年版二部附錄明確規(guī)定沖洗劑需要進行細菌內(nèi)毒素檢查(鱟試劑凝膠法)，不能進行細菌內(nèi)毒素檢查的沖洗劑應(yīng)進行熱原檢查(家兔法)。家兔法存在試驗條件要求較高、操作繁瑣、費時費力且影響因素較多，而細菌內(nèi)毒素檢查法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、簡便易行等優(yōu)點，但是細菌內(nèi)毒素檢查是否可行的前提是供試品在滿足限量檢查要求的濃度下對細菌內(nèi)毒素檢查不產(chǎn)生干擾。

如果樣品在高濃度(低稀釋倍數(shù))時對細菌內(nèi)毒素試驗不產(chǎn)生干擾，則在低濃度(高稀釋倍數(shù))時也不產(chǎn)生干擾。因此，理論上可以選擇靈敏度λ為0.50-0.03 EU/ml的鱟試劑，將樣品稀釋到相應(yīng)的倍數(shù)(1-16倍)進行細菌內(nèi)毒素檢查。但在實際檢驗過程中，為了盡量減少操作步驟(稀釋)和降低對鱟試劑靈敏度的要求，可以選擇靈敏度λ為0.50 EU/ml的鱟試劑，對醋酸洗必泰沖洗劑原液直接進行細菌內(nèi)毒素檢查。

［1］湖北省食品藥品監(jiān)督管理局.湖北省醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范2011年版［M］.武漢:湖北省科學(xué)技術(shù)出版社，2011:355-356.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄88-91.

［3］馬建麗，樸晉華，陳新文，等.注射用復(fù)方甘草酸苷細菌內(nèi)毒素檢查方法的研究［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，41(12):1047-1049.

［4］ 秦美蓉，王平，陳潤樺，等.藥用輔料山梨醇(供注射用)的細菌內(nèi)毒素檢查法［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31(2):207-209.

［5］劉春，趙毓梅，鄭霞.復(fù)方二氯醋酸二異丙胺注射液的細菌內(nèi)毒素檢查法研究［J］.中國藥房，2014，25(1):80-81.

［6］王宗春，彭燕.鱟試劑法檢測硫辛酸注射液細菌內(nèi)毒素的研究［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，44(7):543-546.

［7］蔡彤，裴宇盛，高華.中國藥典2010年版細菌內(nèi)毒素檢查法的修訂建議［J］.藥物分析雜志，2014，34(4):723-726.