張國(guó)強(qiáng) 翟 艷 孫阿林 張立明

1（濰坊醫(yī)學(xué)院 兒科學(xué)教研室，濰坊261053）

2（濰坊市人民醫(yī)院 健康查體中心，濰坊261041）

3（濰坊醫(yī)學(xué)院 內(nèi)科學(xué)教研室，濰坊261053）

4（濰坊市人民醫(yī)院 新生兒科，濰坊261041）

在呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病研究中，將肺組織進(jìn)行石蠟包埋后切片是最基本的方法。文獻(xiàn)報(bào)道肺組織取材方法各異，總結(jié)如下：直接取材；在體／離體氣管灌注后取材［1，2］。筆者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，前述方法對(duì)大鼠或者成年小鼠效果較好，但對(duì)于新生鼠特別是新生小鼠，因其重量小、氣管管徑小、呼吸系統(tǒng)發(fā)育不完善，不易準(zhǔn)確進(jìn)行氣管灌注。勉強(qiáng)進(jìn)行灌注后，也極易造成肺泡結(jié)構(gòu)損傷。對(duì)于新生小鼠，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用肺循環(huán)聯(lián)合體循環(huán)灌注后對(duì)組織進(jìn)行修塊的方法，可以制作出較為理想的新生小鼠肺組織切片，為新生小鼠實(shí)驗(yàn)提供可靠取材方法。

1 材料

新生5天的昆明小鼠16只，每組4只，體重（3．17±0．16）g；1．2一次性使用靜脈輸液器（規(guī)格：0．45×13．5RWLB）；1．3生理鹽水（NS）、4%多聚甲醛（PFA）、石蠟包埋機(jī)、梯度酒精、二甲苯、石蠟切片機(jī)、烤箱、HE染色劑、顯微鏡等。

2 方法

新生小鼠乙醚麻醉后，打開腹腔、胸腔并充分暴露心肺，注意勿傷及心肺組織。

方法A：未行灌注，剪斷腹主動(dòng)脈、下腔靜脈放血處理后取材；

方法B：腹腔放血后行氣管灌注：將靜脈輸液器針頭直接插入氣管并固定后緩慢灌注PFA至肺組織充盈后取材；

方法C：未行腹腔放血，行肺循環(huán)、體循環(huán)灌注后取材：先剪開左心耳，于右心室位置插入靜脈注射器針頭3mm左右，借助心臟搏動(dòng)用NS行肺循環(huán)灌注，至肺組織變白、左心耳出無(wú)血液流出；剪開右心耳并將針頭插入左心室行體循環(huán)灌注至肝臟變?yōu)橥咙S色、右心耳無(wú)血液流出；采取同樣辦法，PFA分別行肺／體循環(huán)灌注2～3min后取材。注意灌注速度不宜過(guò)快，保持40滴／每分，避免肺組織水腫。

取肺方式：左肺于肺門處結(jié)扎、剪下，于NS中漂去表面血跡，將肺組織修剪為2×4×6mm左右大小，然后浸入PFA中固定24～48小時(shí)，后續(xù)水洗、脫水、透明、浸蠟、切片、HE染色按常規(guī)操作。

3 結(jié)果

方法A：肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，紅細(xì)胞廣泛分布（見(jiàn)圖1A）；方法B：肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變形，紅細(xì)胞殘留（見(jiàn)圖1B）；方法C：肺組織結(jié)構(gòu)良好，無(wú)紅細(xì)胞殘留（見(jiàn)圖1C）。

4 討論

新生小鼠肺結(jié)構(gòu)發(fā)育不成熟。文獻(xiàn)報(bào)道，生后5天的小鼠肺組織處于囊泡期［］。腹腔放血后直接取材，肺組織結(jié)構(gòu)不完整，紅細(xì)胞廣泛分布；若腹腔放血后后行氣管灌注，在灌洗液的作用下，肺組織結(jié)構(gòu)將發(fā)生明顯變形；因肺組織為雙重供血（肺循環(huán)供血與起源于體循環(huán)的支氣管動(dòng)脈供血），因此分別行肺循環(huán)、體循環(huán)灌注，可以最大限度保持肺組織形態(tài)，減少肺內(nèi)血液殘留，經(jīng)HE染色證實(shí)，此方法獲得的肺組織結(jié)構(gòu)良好，無(wú)紅細(xì)胞殘留。

圖1 不同方法獲取的新生小鼠肺組織HE染色結(jié)果

取材后修塊的目的在于使肺組織厚度減小，利于固定液滲入；形態(tài)規(guī)整的組織塊亦可以避免二甲苯透明時(shí)因肺組織形態(tài)不規(guī)則而發(fā)生卷曲變形，影響后續(xù)切片。

5 結(jié)論

采取肺／體循環(huán)雙重灌注后修塊的的方式可以最大限度保持新生小鼠肺組織形態(tài)，是新生小鼠肺組織切片的理想方法。

［1］ 李冰，劉同慎．肺組織切片的取材和固定新方法［J］．生物學(xué)通報(bào)，2013，01：61-62．

［2］ 尚宏偉，李寶紅，王興翠，等．大鼠肺組織制片方法的改進(jìn)［J］．首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，02：55-56．

［3］ Ten Have-Opbroek AA．The development of the lung in mammals：an analysis of concepts and findings［J］．Am J Anat，1981，162（3）：201-19．