魯生念，廖永美，趙逵

（遵義醫(yī)學院，貴州遵義563099）

阿司匹林對結腸癌細胞腫瘤干性標記物CD44蛋白表達的影響

魯生念，廖永美，趙逵

（遵義醫(yī)學院，貴州遵義563099）

目的研究人結腸癌細胞系SW-480、HT-29中腫瘤干細胞干性標記物CD44蛋白受阿司匹林不同藥物濃度的影響變化，從而探討阿司匹林是如何預防結直腸癌的發(fā)生。方法采用激光掃描共聚焦顯微技術：免疫熒光雙標染色法檢測結腸癌細胞系SW-480、HT-29中CD44的表達；用Western blotting檢測不同濃度阿司匹林（0、2.5、5.0、10.0 mmol/L，即分別為空白對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組）作用下，CD44在COX-2陰性表達的SW-480細胞及COX-2高表達的HT-29細胞表達影響。結果SW-480、HT-29中存在CD44陽性細胞，2種細胞表達的CD44熒光值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Western blotting結果顯示阿司匹林能抑制結腸癌細胞系SW-480、HT-29中CD44的表達，且具有明顯的量-效關系（P<0.05），2種細胞組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論結腸癌細胞系SW-480、HT-29中存在CD44陽性細胞，阿司匹林能抑制腫瘤干細胞干性標記物CD44的表達，其抑制可能是通過COX-2及非COX-2途徑，該抑制作用可能是阿司匹林能預防結腸癌的原因之一。

阿司匹林；結腸腫瘤；腫瘤干細胞；CD44蛋白

結直腸癌是嚴重危害人類健康的最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在西方發(fā)達國家已經(jīng)居于惡性腫瘤第3位[1]。我國近年來由于環(huán)境、飲食及生活習慣等因素的改變，結直腸癌的發(fā)病率以及患者死亡率呈明顯上升趨勢，如何有效地進行預防及改進治療方法成為目前亟待解決的問題。直至腫瘤干細胞（CSCs）概念[2-3]的提出為腫瘤研究提供了新的方向及思路，是目前放療、化療及生物免疫治療等方法能夠殺滅部分腫瘤細胞的“靶標”，使更有效地治療惡性腫瘤成為可能。

CD44是一種由單基因編碼，具有一個高度保守的N末端的一種跨膜糖蛋白，其基因位于11p13。有研究認為，CD44具有GTP酶活性的鳥嘌呤核苷酸連接蛋白，具有獨特的信號傳遞通路，是一種重要的細胞黏附因子。CD44分布廣泛，它對多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移及臨床預后都至關重要[4]。阿司匹林作為一種臨床常用的非甾體抗炎藥（NSAIDs），除常用于解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等外，常用于預防某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如每天服用該類藥物能降低結直腸腺瘤及癌癥發(fā)生的風險，能抑制甚至逆轉結直腸癌的癌前病變[5-6]，有效地改善患者預后。有大量研究認為，阿司匹林是通過依賴COX-2途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，但針對某些腫瘤并未表達COX-2，NSAIDs仍能抑制腫瘤的發(fā)生。阿司匹林是如何作用于結直腸癌細胞，對CSCs干性標志物CD44產(chǎn)生的影響尚不清楚，本實驗擬通過研究不同濃度阿司匹林對人結腸癌細胞系SW-480、HT-29中CD44蛋白表達的影響以探討其對結直腸癌的潛在影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株人結腸癌細胞株SW-480、HT-29分別購買于重慶醫(yī)科大學細胞實驗室及中國科學研究院上海細胞庫。

1.1.2 藥物和主要試劑阿司匹林、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸（EDTA）購于美國Sigma公司，1640培養(yǎng)基及胎牛血清購于美國Hyclone公司，小鼠抗人CD44單克隆抗體購于美國Cell Signling Technology公司，小鼠抗人β-actin辣根酶標記山羊抗兔IgG及辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購于北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)用含10%胎牛血清及1%雙抗的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人結腸癌細胞株SW-480、HT-29，孵箱的條件設置為37℃、5%CO2，培養(yǎng)瓶為25 cm2，細胞貼壁生長，當生長狀態(tài)良好并融合至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA混合液消化、離心（1000 r/min，5 min），進行傳代培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期、狀態(tài)優(yōu)良的細胞收集用于實驗。

1.2.2 免疫熒光雙標法檢測SW-480和HT-29細胞中CD44的表達將高壓后的無菌蓋玻片置于6孔板中，進行細胞種板，種板時調整每孔細胞密度為0.8×105mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，貼壁后4%多聚甲醛進行固定，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，用0.5%Triton-X-100的PBS通透化15 min，1%牛血清蛋白（BSA）封閉；加入按抗體說明書進行1∶400稀釋的鼠抗人CD44單克隆抗體，室溫避光孵育1 h后4℃過夜，棄去抗體稀釋液后，PBS反復漂洗，加四乙基若丹明異硫氰酸鹽（TRITC）標記的1∶100稀釋的二抗，避光孵育1 h，漂洗后撈片、風干、封固，同時PBS代替一抗用于陰性對照組實驗，共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片，采圖時每張細胞玻片上選取3個比較具有代表性的區(qū)域，按照標準選擇參數(shù)拍照。

1.2.3 Western blotting法檢測結腸癌細胞系SW-480、HT-29細胞中CD44蛋白的表達將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的2種細胞分別進行消化離心，吹打為單細胞懸液，調整密度為5×105mL-1后于25 cm2的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。配置含有阿司匹林的完全培養(yǎng)基，空白對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組藥物濃度分別為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L。細胞貼壁生長24 h后分別加入上述不同組別的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h后收集細胞用于實驗。裂解液（RIPA）提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，定濃度為80 μg/μL，10%的聚丙烯酰胺凝膠上量20 μL（每孔約30 μg）進行電泳，恒壓轉膜（40 mV，4 h）后，予5%脫脂蛋白封閉1h，0.1%洗膜緩沖液（TBST）洗3次后加入1∶1 000稀釋的小鼠抗人CD44單克隆抗體以及1∶5 000稀釋的小鼠抗人β-actin一抗，搖床上4℃過夜，TBST漂洗，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG室溫下孵育1 h，TBST再次漂洗，應用魯米諾熒光顯色，暗室內膠片曝光，根據(jù)膠片上顯影效果，調整曝光時間直至出現(xiàn)最佳條帶，電腦掃描，結果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組內比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 激光共聚焦免疫熒光雙標結果

2.1.1 免疫熒光分析CD44在結腸癌細胞系SW-480、HT-29細胞中的表達見圖1。

圖1 免疫熒光法分析CD44在SW-280、HT-29中的表達（×200）

2.1.2 免疫熒光雙標法檢測CD44在SW-480、HT-29細胞中表達的熒光值分別104.110±3.123、83.771±3.999，其在這2種結腸癌細胞中的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 結腸癌細胞系SW-480、HT-29細胞中CD44熒光值比較

2.2 Western blotting法分析不同組別阿司匹林對結腸癌細胞系SW-480、HT-29細胞中CD44蛋白表達的影響Western blotting法檢測結果顯示，在SW-480、HT-29細胞中，由空白對照組-低濃度-高濃度阿司匹林組，CD44蛋白印記條帶顏色均是由深至淺（圖3）。SW-480細胞實驗組中CD44蛋白的校準值（CD44蛋白的積分光密度值/β-actin蛋白的積分光密度值）分別為1.31850±0.12497、0.987 80±0.143 99、0.738 00±0.134 07，相比較于空白對照組1.618 0±0.1331 2均較低。HT-29細胞中實驗組中CD44蛋白的校準值（CD44/β-actin）分別為1.238 50± 0.117 04、1.121 80±0.155 28、0.793 20±0.124 95，相較于空白對照組1.552 3±0.148 37均較低。對照組與不同實驗組結果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但是SW-480、HT-29細胞組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3、4。

圖3 Westem blotting檢測SW-480、HT-29細胞中不同藥物濃度時CD44蛋白的表達

圖4 SW-480、HT-29細胞中不同組別CD44蛋白的表達（CD44/β-actin校準值）的比較

3 討論

結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個異常復雜的過程，涉及多基因、多階段、多因素的影響，腫瘤干細胞理論認為，CSCs是腫瘤的“起始細胞”或“動力細胞”，是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移以及反復復發(fā)的源泉，起著關鍵作用。目前研究認為，結腸癌干細胞可能起源于正常結腸隱窩干細胞，當此類細胞出現(xiàn)功能紊亂，例如自我更新、分化、克隆增殖和凋亡失去平衡[7]，可能直接或間接導致結直腸癌的發(fā)生，這類細胞很有可能就是腫瘤干細胞的最早起源。腫瘤干細胞是腫瘤細胞中含量極少的具有干細胞特性的細胞，能持續(xù)自我更新及不斷分化出有不同增殖能力的細胞[8]，這可能是腫瘤不斷侵襲、轉移及復發(fā)，傳統(tǒng)抗腫瘤治療無效及放化療產(chǎn)生耐受的根本原因。CD44通過介導細胞間、細胞與基質間的相互作用，在腫瘤細胞黏附、新生血管形成和腫瘤增殖、侵襲及轉移中發(fā)揮重要作用[9]，Blacking等[10]在動物細胞中的研究顯示，細胞周期中所處的位置與CD44的表達水平與增殖能力緊密相連。目前已有多項研究表明CD44與結直腸癌、胃癌、皮膚癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[11]。研究發(fā)現(xiàn)在結腸腺瘤向結腸癌的發(fā)展過程中，在K-ras基因突變相關影響下，CD44基因的表達會逐漸上調，甚至比P53等基因的變化還早，證實CD44可作為結直腸腫瘤發(fā)生早期檢測的重要分子標志物之一。CD44在正常腸黏膜中幾乎呈陰性表達，但在結直腸癌或伴不典型增生的腺瘤組織中，其呈局灶狀分布于腺管周圍，并且在癌組織中的表達與腺瘤組織中的表達均有顯著性差異。研究發(fā)現(xiàn)，CD44從增生性息肉到腺瘤性息肉表達逐漸上調，尤其在腺瘤性息肉和腺癌組織中表達明顯，提示其從正常腸黏膜到腺瘤直至發(fā)展到癌的轉變過程中可能發(fā)揮了關鍵作用[10]，并且研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌的淋巴轉移、病理分級及Dukes分期都與CD44的表達密切相關[12]。有研究發(fā)現(xiàn)CD44陽性的結腸癌細胞裸鼠皮下成瘤實驗陽性，而CD44陰性者并不具備動物體內成瘤能力。多項研究已發(fā)現(xiàn)CD44分子參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展，本實驗發(fā)現(xiàn)HT-29及SW-480中都明確存在CD44陽性細胞，CD44作為結直腸癌的腫瘤相關干性標記物，可能成為結直腸癌治療的新靶點。

已有大量研究證實，每天按規(guī)定服用阿司匹林或其他非甾體類抗炎藥物可有效地預防結直腸癌的發(fā)生，降低患癌危險性及癌癥病死率，也能降低術后復發(fā)率、改善患者生活質量、提高5年生存率等[13]。研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林的作用與腫瘤的病理類型、臨床分期甚至患者服用藥物的時間相關，與腫瘤COX-2表達水平也有所關聯(lián)。Cardwell等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，明確診斷患結直腸癌后每天服用阿司匹林能夠改善患者的預后，提高患者生存率，特別是針對COX-2過度表達的原發(fā)性腫瘤患者，但是診斷前服用與預后改善卻無明顯相關性。所以NSAIDs是如何預防、治療癌癥的機制目前尚不十分清楚，CD44作為結腸癌的干性標記物，與阿司匹林預防結腸癌的作用是否相關尚不明確。本實驗結果顯示，在結腸癌細胞SW-480和HT-29細胞中，CD44蛋白的表達隨著阿司匹林藥物濃度的不斷增加呈明顯逐級下降趨勢，并具有明顯的藥物濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這表明阿司匹林預防結直腸癌的作用可能是通過抑制CD44蛋白的表達從而抑制細胞中腫瘤干細胞的分化及增殖。因癌組織中COX-2的mRNA和蛋白質的表達可顯著升高，故普遍認為阿司匹林的預防作用是因為NSAIDs能夠抑制環(huán)氧化酶（COXs）的合成，從而減少花生四烯酸轉化為前列腺素，在極大部分的結直腸癌及癌前病變組織中可檢測到COX-2的高表達，所以大部分研究認為NSAIDs是通過抑制COX-2表達，從而阻斷癌細胞的分化增殖、遷移，但選擇性COX-2抑制劑能夠阻礙Wnt/ β-catenin信號通路是通過誘導TCFs降解的原因，但卻不依賴COX-2途徑[15]。本實驗中CD44的表達在SW-480（COX-2陰性表達）及HT-29（COX-2高表達）2種細胞組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明阿司匹林抗大腸腫瘤的機制并非僅僅涉及COX-2途徑，可能也與非COX-2途徑密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對COX-2高表達的結腸腺瘤患者無明顯作用，卻可降低低表達COX-2患者的復發(fā)率。NSAIDs可以抑制陰性表達COX-2的腫瘤細胞系SW-480、HCT116細胞的增殖，Nath等[16]證實，NSAIDs可以阻斷Wnt/β-catenin信號傳導途徑，從而抑制非雄激素依賴性前列腺癌細胞的增殖；另外，阿司匹林可抑制胚胎纖維原細胞的生長，而該細胞并不表達COX-2基因。在不同藥物濃度的阿司匹林影響后，在COX-2陰性和陽性表達的細胞中都能檢測到腫瘤干細胞標記物CD44的降低，且均有量效關系。所以研究認為非甾體類抗炎藥物是通過多種信號傳導通路對結直腸癌產(chǎn)生的預防治療作用，其中非COXs依賴途徑是主要的通路之一，根據(jù)實驗結果推測可能是通過抑制CD44腫瘤干細胞標記物的表達，從而抑制腫瘤細胞生長增殖，從而達到預防甚至治療結直腸癌的作用。但關于阿司匹林預防結腸癌發(fā)生發(fā)展與CD44相關通路的具體機制仍需要進一步的研究。

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Treatment with aspirin inhibiting the expression of tumor stem marker CD44 in human colorectal cancer cells

Lu Shengnian，Liao Yongmei，Zhao Kui
（Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563099，China）

Objective To investigate the effects of aspirin affected by changes in the concentration of different drugs on CD44，which was supposed to be the marker of tumor stem cells in colon cancer cell line SW-480 and HT-29 so as to explore how to prevent the occurrence of colorectal cancer with aspirin.Methods The expression of CD44 in the colon cancer cell line SW-480 and HT-29 cells was observed by laser scanning confocal microscopy and immunofluorescence double staining.The expression of CD44 protein in human colon cancer SW480（negative expression of COX-2）and HT-29（high expression of COX-2）cells with aspirin at different concentrations（0，2.5，5.0，10.0 mmol/L，namely the control group，the low-concentration group，the middleconcentration group and the high-concentration group）were detected by Western blotting.Results CD44+cells existed the SW-480 and HT-29 cells.There were statistical significance fluorescence value expressed by two kinds of cells.The difference had statistical significance（P<0.05）.Asprin could inhibit the expression of colon cancer cell line SW-480 and HT-29 by Western blotting，which showed an obvious dose-effect relationship（P<0.05）.There were no statistical significance in difference between the two kinds of cells（P＞0.05）.Conclusion CD44+cells exist in the SW-480 and HT-29 cells.Aspirin may inhibit the expression of CD44 protein，the tumor stem maker in the colon cancer cell line SW-480 and HT-29，which was supposed to be acted by COX-2 and non COX-2 pathways.Asprin is probably one of factors to prevent colorectal cancer.

Aspirin；Colonic neoplasms；Neoplastic stem cells；CD44 protein

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.002

A

1009-5519（2015）03-0323-03

2014-11-02）

貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費資助項目（TZJF-2011-32）。

魯生念（1988-），女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事消化系統(tǒng)課題的研究；E-mail：780583556@qq.com。

趙逵（E-mail：kuizhao95868@MSN.com）。