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七彩紅竹IhCCR-1基因的克隆與分析*

繆福俊1,2，原曉龍1,2，陳劍1,2，楊宇明1,2，王娟1,2

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明650201；2.國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室；

云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201)

摘要：肉桂酰輔酶A還原酶(Cinnamoyl-CoA reductase，CCR)是苯丙烷類(lèi)代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在七彩紅竹木質(zhì)素和花青素合成代謝流向中起重要作用。依據(jù)七彩紅竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異引物，采用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)從七彩紅竹中克隆得到一個(gè)新的CCR基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為IhCCR-1(登錄號(hào)：KP271440)。結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)cDNA為1 038 bp，編碼345個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，屬于酸性穩(wěn)定蛋白，不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白；IhCCR-1蛋白具有保守的KNWYCYGK催化位點(diǎn)，屬于NADB-Rossmann超家族，相對(duì)分子量為37.61 kDa；IhCCR-1與其他植物的CCR具有較高的親緣關(guān)系。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究七彩紅竹木質(zhì)素產(chǎn)生的分子機(jī)理和綜合開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：七彩紅竹；木質(zhì)素；花青素；肉桂酰輔酶A還原酶基因；克??；基因分析

七彩紅竹(Indosasahispidacv.Rainbow)是蒲竹仔植物的變種，可產(chǎn)花色素苷[1～2]。因富含花色素苷，具有抗衰老、防輻射、增強(qiáng)免疫力等保健功能，具有重要的觀賞價(jià)值和潛在的商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值[3～5]。七彩紅竹的二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)屬非Asn/Asp型，其編碼的第134位氨基酸堿基發(fā)生突變誘發(fā)花色素苷的大量合成，從而導(dǎo)致了浦竹仔產(chǎn)生紅色稈的個(gè)體[6]。竹子為多年生木質(zhì)化植物，生長(zhǎng)快，易繁殖，是造紙工業(yè)的重要原材料，但其木質(zhì)素嚴(yán)重影響了竹漿品質(zhì)，增加造紙成本，同時(shí)造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染[7]。然而，木質(zhì)素和花色素苷的合成同屬苯丙烷類(lèi)代謝途徑的兩個(gè)分支[8-9]?；ㄉ剀张c木質(zhì)素生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)的兩個(gè)重要調(diào)控節(jié)點(diǎn)分別是DFR和CCR，二者都以苯丙氨酸為前體，其CCR基因的表達(dá)直接影響著苯丙氨酸代謝流的底物轉(zhuǎn)化走向和下游代謝的行進(jìn)[10～11]。目前，CCR基因已在多種植物中(玉米Zeamays、丹參Salviamiltiorrhiaz、竹子Pleioblastusmaculosoides等)發(fā)現(xiàn)[10]。宋恩慧等人和Rest等人通過(guò)CCR基因的控制表達(dá)，改變木質(zhì)素代謝途徑，使其向纖維素和花色素苷代謝流行進(jìn)[12～13]。如果能將產(chǎn)花色素苷的DFR基因轉(zhuǎn)入巨龍竹(Dendrocalamussinicus)中，進(jìn)一步干涉其CCR基因的表達(dá)，讓巨龍竹產(chǎn)大量的花色素苷，即可提取花色素苷又可降低木質(zhì)素含量，或成為一種竹類(lèi)調(diào)控代謝途徑產(chǎn)物積累量的新思路。目前巨龍竹主要用于造紙用途，因含大量的木質(zhì)素而嚴(yán)重影響造紙品質(zhì)，同時(shí)對(duì)環(huán)境造成了污染。故本研究對(duì)七彩紅竹CCR基因進(jìn)行克隆與分析，為深入研究七彩紅竹花色素苷和木質(zhì)素代謝途徑相關(guān)基因功能提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

七彩紅竹采自云南省林業(yè)科學(xué)院溫室棚(引自云南普洱地區(qū))，采集幼嫩竹稈，經(jīng)液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1CCR基因的克隆

RNA提取：按RNA提取試劑盒(TIANGEN公司)說(shuō)明操作。

cDNA合成：按cDNA Synthesis Kit試劑盒(TAKARA公司)說(shuō)明操作。

CCR基因克?。阂?由上海生工公司合成)：根據(jù)課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物(上游引物F：5’-ATGACCGTCGTCGACGTCGCT-3’；下游引物R：5’-TCATGCCGTCACACCGTTCAGTTC-3')。反應(yīng)體系為25 μL(cDNA：1 μL；F：1 μL；F：1 μL；PrimeSTAR MAX DNA Premix(2×)：12.5 μL；ddh20：9.5 μL)；反應(yīng)條件(98℃：10 s；55℃：5 s；72℃：10 s)30 Cycles。用DNA回收試劑盒(上海生工公司)切膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物后，連接載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，用菌液PCR法鑒定陽(yáng)性克隆，送上海生工公司測(cè)序。

1.2.2CCR基因序列分析

對(duì)獲得的CCR基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析[6]，結(jié)構(gòu)功能域?yàn)镹CBI(http://www.ncbi.nih.gov)中Conserved Domain Database數(shù)據(jù)庫(kù)搜索；理化性質(zhì)預(yù)測(cè)為ProtParam(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)；聚類(lèi)樹(shù)構(gòu)建為MEGA 3.0軟件；信號(hào)肽預(yù)測(cè)為SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；亞細(xì)胞定位為WoLF PSORT(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)；拉氏圖構(gòu)建為PROCHECK(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/)。

2結(jié)果與分析

2.1IhCCR-1基因的克隆和序列分析

七彩紅竹IhCCR-1基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增結(jié)果如圖1-A所示，陽(yáng)性克隆檢測(cè)結(jié)果如圖1-B所示。在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)，GenBank登錄號(hào)為KP271440。經(jīng)測(cè)序IhCCR-1全長(zhǎng)cDNA為1038 bp。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)該基因能編碼一個(gè)長(zhǎng)345個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(圖2)。IhCCR-1蛋白的相對(duì)分子量為37.61 kDa，化學(xué)方程式為C1666H2637N461O504S13，脂肪系數(shù)為93.51，為穩(wěn)定的酸性蛋白(等電點(diǎn)：5.52；半衰期：30 h；不穩(wěn)定參數(shù)：31.22)。該蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白，可能在細(xì)胞質(zhì)中合成，不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。亞細(xì)胞定位表明該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成。

AB

圖1IhCCR-1基因克隆相關(guān)電泳圖

注：A為IhCCR-1反轉(zhuǎn)錄-PCR電泳圖，B為陽(yáng)性克隆電泳圖

Fig.1The related electrophoretograms ofIhCCR-1 gene cloning

圖2　IhCCR-1基因cDNA全長(zhǎng)及推測(cè)的氨基酸序列

2.2蛋白序列結(jié)構(gòu)域分析

IhCCR-1蛋白預(yù)測(cè)顯示由41.16 %的A螺旋、43.48 %的不規(guī)則卷曲和15.36 %的延伸鏈組成。該蛋白具有PLN02214保守結(jié)構(gòu)(圖3)，屬于NADB-Rossmann超家族。

IhCCR-1具有典型的保守序列KNWYCYGK(圖4)，為該蛋白的催化位點(diǎn)。目前的研究表明，KNWYCYGK序列是植物CCR蛋白的催化位點(diǎn)[10]。

圖3　IhCCR-1結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖4　IhCCR-1和其他物種CCR部份氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.3IhCCR-1編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

IhCCR-1蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象呈現(xiàn)致密球狀結(jié)構(gòu)(圖5-A)，主要由9條B折疊、12個(gè)大小不等的A螺旋和一些不規(guī)則卷曲組成。同源建模結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)殘基的二面角位于黃色核心區(qū)域(圖5-B)，表明其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，建模結(jié)果可靠。

AB

圖5IhCCR-1蛋白三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)(A)和拉氏構(gòu)象圖(B)

注：紅色為α-螺旋；黃色為β-折疊延伸鏈；綠色為無(wú)規(guī)卷曲

Fig.5The prediction of tertiary structure (A)and Ramachandram plot prediction (B) of IhCCR-1 protein

2.4IhCCR-1編碼氨基酸同源比對(duì)分析

經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blastp后，選取10個(gè)物種構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)。不同物種CCR氨基酸序列的聚類(lèi)樹(shù)見(jiàn)圖6所示，IhCCR-1基因編碼的氨基酸序列與其他植物中CCR具有99 %的相似性。

圖6CCR氨基酸序列的同源性分析

注： 基于Neighbor-Joining方法構(gòu)建，各節(jié)點(diǎn)處數(shù)字表示boorstrap值，重復(fù)1 000次，小數(shù)點(diǎn)表示Branch Length值，

不同物種CCR氨基酸序列聚類(lèi)圖(標(biāo)尺上的數(shù)字代表相似性)

Fig.6The homology analysis of CCR amino acid sequence

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

本研究采用反轉(zhuǎn)錄PCR從七彩紅竹中克隆獲得木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵CCR基因，命名為IhCCR-1(登錄號(hào)KP271440)。該基因全長(zhǎng)cDNA為1 038 bp，編碼345個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，屬于酸性穩(wěn)定蛋白；IhCCR-1蛋白具有保守的催化位點(diǎn)，相對(duì)分子量為37.61 kDa。

3.2討論

本研究獲得的IhCCR-1基因，其生物信息學(xué)分析顯示該蛋白屬于NADB-Rossmann超家族，與其他植物中CCR具有很高的同源性。IhCCR-1具有保守的KNWYCYGK催化位點(diǎn)，是植物CCR蛋白的保守序列。該保守的催化位點(diǎn)(KNWYCYGK)在有些植物中發(fā)生了變異，如玉米ZmCCR-1的保守序列為RNWYCYGK，丹參SmCCR-2的保守序列為KNWYCYSK，這些變異可能與CCR催化形成木質(zhì)素的種類(lèi)和含量不同有關(guān)[10]。IhCCR-1蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白，可能在細(xì)胞質(zhì)中合成，不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。亞細(xì)胞定位表明該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成，研究結(jié)果與已報(bào)道的CCR一致[14]。

七彩紅竹是浦竹仔的變種，可以產(chǎn)花色素苷，這在竹類(lèi)中還是首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)，已克隆的InDFR-1基因分析表明，是由第134位氨基酸的堿基發(fā)生突變[6]，進(jìn)而改變苯丙氨酸代謝流向，合成大量的花色素苷，但在其合成過(guò)程中，其旁路途徑中CCR基因的表達(dá)與否還有待后期進(jìn)一步的研究。目前的相關(guān)研究表明通過(guò)改變CCR的活性影響木質(zhì)素的含量培育出新性狀轉(zhuǎn)基因植物，以及研究其與細(xì)胞壁的生成、抗病、抗逆等抗性方面的關(guān)系，這些為今后的深入研究其木質(zhì)素和花色素苷代謝途徑的耦合關(guān)系提供理論依據(jù)。

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[下轉(zhuǎn)第75頁(yè)]

Cloning Analysis of a Cinnamoyl-CoA Reductase Gene from

Indosasa hispida cv.Rainbow

MIAO Fu-jun1，2，YUAN Xiao-long1，2，CHEN Jian1，2，YANG Yu-ming1，2，WANG juan1，2

(1.Yunnan Academy of Forestry, Kunming Yunnan 650201, P.R.China;2.Key Laboratory for Conservation of Rare,Endangered &

Endemic Forest Plants,State Forestry Administration,Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and

Exploitation of Forest Plants,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

Abstract:Cinnamoyl-CoA reductase (CCR) is a key enzyme in the phenylpropanoid pathway, and plays a critical role in metabolic flow of lignin and anthocyanin.In this study,we cloned the full-length of cDNA of a novel CCR gene from Indosasa hispida cv.Rainbow with the method of reverse transcription PCR and gene-specific primers using a semi-quantitative RT-PCR technique according to the transcriptome sequencing data.This novel gene was named as IhCCR-1(Accession Number：KP271440).It has a length of 1 038 bp and encoded with a protein of 345 amino acids.The IhCCR-1 protein is a stable acidic and non-secretory protein that has no signalpeptide.The IhCCR-1 protein belonged to the NADB-Rossmann superfamily and contained the conserved KNWYCYGK motif.IhCCR-1 is closely related to the other plants.The results above would lay a theoretical basis for further exploration of molecular mechanism of lignin and for the comprehensive exploitation and utilization of Indosasa hispida cv.Rainbow.

Key words:Indosasa hispida cv.Rainbow; lignin; anthocyanins; Cinnamoyl-CoA reductase；clone; gene analysis

中圖分類(lèi)號(hào)：S 792.15

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-8246(2015)05-0057-06

通訊作者簡(jiǎn)介：王娟(1966-)，女，教授，博士，主要從事生物多樣性保護(hù)和竹類(lèi)植物研究。E-mail：schima@163.com

作者簡(jiǎn)介：第一繆?？?1986-)，男，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事植物分子和微生物學(xué)研究。E-mail：miaofujun@yeah.net

基金項(xiàng)目：云南省基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2013FA054),云南省自然科學(xué)基金(2009CD073),云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才 培養(yǎng)項(xiàng)目(2010CI016),國(guó)家林業(yè)局948項(xiàng)目(2008-4-30)。

收稿日期：*2015-04-15

doi10.16473/j.cnki.xblykx1972.2015.05.011