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西南樺優(yōu)良無性系組培快繁技術(shù)*

陳芳1,2，白平1，李勇杰1，陳海云1，徐田1，師春娟1，聶艷麗3，董曉光3，陸斌3，包晴忠4

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明650201；2.國家林業(yè)局重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室；

云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201；3.云南林業(yè)技術(shù)推廣站，云南昆明650201；

4.西雙版納州林業(yè)局，云南景洪666100)

摘要：為高效集約經(jīng)營云南鄉(xiāng)土珍貴用材樹種西南樺，在云南思茅、德宏選22個(gè)優(yōu)良無性系為試材，從取材、材料的處理、外植體的誘導(dǎo)分化、芽的增殖、生根等方面探討了西南樺組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)和方法，結(jié)果表明，西南樺無性系間增殖系數(shù)及生根率均有一定差異，適宜增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L，增殖系數(shù)可達(dá)3～6倍，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L，生根率可達(dá)94.4 %。

關(guān)鍵詞：西南樺；無性系；組織培養(yǎng)

西南樺(Betulaalnoides)是云南省熱帶及亞熱帶地區(qū)優(yōu)良速生鄉(xiāng)土用材林和高效的生態(tài)公益林樹種，生長快，抗性強(qiáng)，材質(zhì)優(yōu)，弦徑向干縮比僅為1.056，不易變形，花紋及色澤美觀，是制作高檔家具和木地板的理想材料[1]，2013年每立方達(dá)3 000元以上，在云南德宏、版納及思茅地區(qū)均有分布及人工種植。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年中國西南樺人工林面積達(dá)到9×105hm2，1990年以來，中國對西南樺開展了比較系統(tǒng)的研究，對其生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性、種質(zhì)資源調(diào)查、種源試驗(yàn)與良種選育、育苗技術(shù)、造林技術(shù)、生長適應(yīng)性和豐產(chǎn)性及生態(tài)效益等方面進(jìn)行了研究，取得了重大進(jìn)展和豐碩成果[2]。

在育苗技術(shù)方面發(fā)現(xiàn)西南樺實(shí)生苗人工林分化比較嚴(yán)重[3]，而通過選優(yōu)，以優(yōu)良單株為材料進(jìn)行組培的無性系人工林分化較小，林相整齊，便于集約化經(jīng)營管理，有利于提高單位面積林木生長量，2010年4月云南省林業(yè)科學(xué)院從云南思茅、德宏兩地選了22個(gè)單株進(jìn)行組培無性繁殖技術(shù)研究，建立無性繁育體系，并建立了無性系子代觀察林，為云南培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)西南樺無性系種苗提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

材料取自普洱市、西盟及孟連、德宏的芒市，參照優(yōu)樹研究的方法[4]選擇優(yōu)良單株22株，采當(dāng)年生枝條莖段、2年生枝條莖段及樹干萌生芽。

1.2試驗(yàn)方法

外植體消毒材料采集后，剪去葉片，用軟毛筆輕輕刷洗，清洗干凈后，在超凈工作臺上，用0.1 % Hgcl2滅菌5-10 min，再用無菌水沖洗4～5次，然后約2～3 cm分節(jié)切割，接種在初代培養(yǎng)基MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

初代誘導(dǎo)培養(yǎng)當(dāng)萌發(fā)的新梢長到2～3 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，繼代培養(yǎng)幾次后，母瓶擴(kuò)繁到一定數(shù)量時(shí)，即可切取1.5～2.0 cm的莖尖進(jìn)行生根試驗(yàn)[5～6]。

芽增殖培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基篩選確定MS后，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素及生長素〔細(xì)胞分裂素KT(6-糠基氨基嘌呤)、BA(6-芐基氨基嘌呤)及生長素NAA(α-萘乙酸)〕13組培養(yǎng)基(表3)，進(jìn)行對比試驗(yàn)，pH值5.8±0.2，蔗糖30 g/L,瓊脂0.5 %～0.6 %。

生根培養(yǎng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度配比的生根誘導(dǎo)劑IBA(吲哚丁酸)、NAA，10組培養(yǎng)基(表5)，蔗糖10 g/L，培養(yǎng)基的pH值5.8±0.2[7～8]。以上培養(yǎng)室溫度25±5℃，光照強(qiáng)度4 000±1 000 lux,光照時(shí)間12 h/d。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用對比試驗(yàn)，每組培養(yǎng)基接種10個(gè)外植體，重復(fù)3次。分化芽形成后，芽生長到0.5 cm，進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)出芽的個(gè)數(shù)，計(jì)算芽增殖系數(shù)(增殖系數(shù)=形成叢芽數(shù)/接種數(shù))生根試驗(yàn)，當(dāng)增殖到一定數(shù)量時(shí)，按節(jié)2～3 cm,進(jìn)行分切進(jìn)行生根試驗(yàn)，每組接種30個(gè)節(jié)段，3次重復(fù)，30天生根后，按根長0.5 cm的進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，計(jì)算生根率(生根率=生根數(shù)/接種數(shù))，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1芽的誘導(dǎo)與增殖

2.1.1枝條年齡對芽增殖率的影響

選用莖段及芽較多的S-1的優(yōu)良單株做試驗(yàn)材料，以MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L為誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。西南樺由于其自身原因，高度分化，脫分化過程較為漫長，從芽接種到叢生芽形成時(shí)間比較長，約需90-120天，而巨尾桉(Eucalyptusgrandis×E.urophylla)僅需20-30天。西南樺需30天左右轉(zhuǎn)接1次，更換新鮮培養(yǎng)基，補(bǔ)充營養(yǎng)，枝條年齡對芽增殖有明顯影響(表1)。經(jīng)過3個(gè)繼代周期，不同外植體年齡，形成叢生芽數(shù)差異較大，2年生枝條增殖率只有80 %，當(dāng)年生萌芽條作外植體，增殖率可達(dá)367 %，但消毒滅菌較難控制，時(shí)間稍長，污染率低，且芽易褐化死亡。如果消毒處理時(shí)間短，污染率又高，但芽萌動快，出芽率高，這可能是芽幼態(tài)，分生細(xì)胞還處于活躍狀態(tài)。

表1　不同年齡的外植體芽增殖情況

2.1.2基本培養(yǎng)基對芽增殖的影響

以S-1的優(yōu)良單株做試材，選用含高、中、低無機(jī)鹽的MS、H、WH培養(yǎng)基3種基本培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明3種培養(yǎng)基差異顯著：在MS培養(yǎng)基中，增殖較好，經(jīng)過誘導(dǎo)能分化叢芽，芽增殖系數(shù)為4.52倍；在WH可能是無機(jī)鹽濃度較低，增殖系數(shù)最低，僅為2.03；H培養(yǎng)基居中。而在叢生芽繼代培養(yǎng)中，3種培養(yǎng)基增殖系數(shù)差異不顯著。西南樺芽增殖在各營養(yǎng)成分較豐富的MS培養(yǎng)基較好(表2)。

表2　基本培養(yǎng)基對西南樺芽增殖的影響

注：激素添加BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L。

2.1.3細(xì)胞分裂素對芽增殖的影響

在MS培養(yǎng)基中附加不同濃度的細(xì)胞分裂素BA和KT(表3)。在無細(xì)胞分裂素的對照試驗(yàn)中，只形成單芽，芽徑直向上生長，沒有形成叢芽。添加BA和KT在1～2 mg/L，在芽初代培養(yǎng)和繼代增殖培養(yǎng)中明顯有促進(jìn)作用，增殖系數(shù)逐漸增加，KT刺激作用略高于BA；當(dāng)BA或KT濃度超過3.0 mg/L，芽增殖系數(shù)反而下降，苗出現(xiàn)畸形；而同時(shí)添加BA和KT時(shí)，初始培養(yǎng)和繼代增殖培養(yǎng)芽增殖系數(shù)有顯著提高；同時(shí)添加BA 1.0 mg/L和KT 0.5 mg/L時(shí)，芽增殖系數(shù)最高，分別達(dá)到3.8倍和4.3倍，苗健壯，葉色濃郁，說明2種細(xì)胞分裂素在一定濃度范圍內(nèi)，配合使用對芽增殖生長較好；但當(dāng)BA濃度為2.5 mg/L，KT 2.0 mg/L或再加大用量時(shí)，芽增殖系數(shù)降低，并出現(xiàn)大量畸形苗，說明西南樺莖段離體培養(yǎng)中，BA和KT一起使用，效果較好，但需要一定的濃度配比，促進(jìn)西南樺莖段培養(yǎng)的芽增殖系數(shù)3～4，苗健壯的培養(yǎng)基為MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L。

表3　外源激素對西南樺離體培養(yǎng)芽增殖的影響

2.1.4不同無性系芽增殖

當(dāng)芽增殖培養(yǎng)基采用MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L，把從思茅及德宏22個(gè)優(yōu)良無性系莖尖及莖段按清洗消毒滅菌后，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，20-25天后芽開始萌動，30-40天伸長，當(dāng)芽伸長到3～4 cm，2～3節(jié)時(shí)，即可分切轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，30天后逐漸形成芽叢，60天左右再分切繼代培養(yǎng)，60-65天繼代1次，增殖率可達(dá)3～6倍。經(jīng)過5次轉(zhuǎn)接，22個(gè)無性系誘導(dǎo)成功，平均增殖率達(dá)3～6倍，S-1、D-12號經(jīng)過5次繼代達(dá)5～6倍(表4)。

表4　不同無性系增殖率試驗(yàn)

2.2根的誘導(dǎo)

2.2.1激素組合對生根的影響

當(dāng)試管苗增殖到一定數(shù)量，即可開始生根試驗(yàn)，切取2～3 cm的健壯西南樺試管綠苗接種在生根培養(yǎng)基上。在空白對照組中，接種到30天后，均未見生根；添加不同濃度的IBA及NAA，10-15天試管苗基部開始膨大，發(fā)根，隨濃度的增加，生根率明顯提高，增加到5.0 mg/L時(shí)，接種后15天生根率為11.2 %，30天后達(dá)20.1 %，但苗基部愈傷塊較大，組織疏松，根粗，根從愈傷組織上伸出，沒有和韌皮部連接，脆易斷，移栽成活率不高；而NAA和IBA配合使用，IBA 1.0 mg/L，NAA 2.0 mg/L時(shí)，接種后15天生根率為15.1 %，30天后生根率達(dá)91.2 %，根從莖韌皮部發(fā)出，愈傷組織較小，須根較多，可形成2～3級須根，移栽成活率較高，可達(dá)80 %以上(表5)。

表5　激素組合對生根的影響

表6　不同無性系生根率

2.2.2不同無性系生根試驗(yàn)

從22個(gè)單株建立的無性繁育體系中，取2～3 cm的綠苗，接種在1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)各無性系生根差異明顯，最好的是S-1生根率可達(dá)94.4 %，D-12達(dá)92.2 %，而S-12僅為27.8 %(表6)。

2.3試管苗的移栽

當(dāng)苗生長到5～6 cm，出現(xiàn)2～3級須根時(shí)，把培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，放置在散射光較強(qiáng)處逐步從光照強(qiáng)度4 000 lx，增加到10 000 lx進(jìn)行煉苗，提高試管苗木質(zhì)化程度，當(dāng)苗莖干發(fā)紅，葉片角質(zhì)化后，擰松瓶蓋，移栽前2天將瓶蓋打開，1-2天后取出瓶苗，用自來水沖洗，洗凈培養(yǎng)基，用10 %的多菌靈浸泡1 min,即可移植到大棚或溫室的苗床上，基質(zhì)采用疏松腐質(zhì)土和生土(按1：1的比例)裝4 cm×8 cm的營養(yǎng)袋；試管苗移植成活率與生長季節(jié)和移栽地氣候關(guān)系較大，移栽試驗(yàn)在寧洱進(jìn)行，2-3月成活率較高，可達(dá)85 %以上，4-5月由于氣溫較高，移栽難度較大，成活率僅為50 %左右，估計(jì)這與普洱當(dāng)?shù)貧夂驐l件有關(guān)。

3結(jié)語

采用芽及莖段離體無性繁殖，未經(jīng)愈傷組織階段，通過添加細(xì)胞分裂素，抑制頂端優(yōu)勢，促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)，以芽繁芽，較好的保持單株的優(yōu)良特性。

以西南樺芽為外植體進(jìn)行組培試驗(yàn)，從外植體接種到叢生芽的形成時(shí)間較長，需3～4個(gè)繼代周期培養(yǎng)，約120-180天，細(xì)胞脫分化啟動較緩，這可能與木本植物特性有關(guān)。

在相同條件下培養(yǎng)，有2個(gè)無性系增殖率相對較高，即S-1及D-12，其他無性系差異不明顯，在生產(chǎn)中，有待對各無性系試管苗建立觀測林后，對各無性系進(jìn)行綜合觀測評價(jià)，選擇試管增殖及生根率高，長勢較好的無性系進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。

西南樺實(shí)生苗遺傳變異大，扦插生根率不高，進(jìn)行西南樺優(yōu)良無性系組培繁育將有助于云南省培育優(yōu)質(zhì)高效人工林提供技術(shù)支撐。

通過采集優(yōu)良單株上的材料進(jìn)行無性繁殖的試管苗，再返回原生地進(jìn)行無性系子代測定，觀察其生長狀況，其結(jié)果將在隨后論文報(bào)道。

致謝：本課題得到中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)中心諶江輝博士的大力支持和幫助，特此表示感謝！

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Fast Propagation of Fine Clones of Betula alnoides

CHEN Fang1,2，BAI Ping1,LI Yong-jie1,CHEN Hai-yun1,XU Tian1,SHI Chun-juan1,

NIE Yan-li3, DONG Xiao-guang3, LU Bin3, BAO Qing-zhong4

(1.Yunnan Academy of Forestry,Kunming Yunnan 650201,P.R.China;2.Yunnan Laboratory for Conservation of Rare,

Endangered & Endemic Forest Plants,Public Key Laboratory of the State Forestry Administration;Yunnan Provincial Key Laboratory of

Cultivation and Exploitation of Forest Plants,Kunming Yunnan 650201，P.R.China;3.Yunnan Provincial Forestry Technology Promotion Center,

Kunming Yunnan 650201，P.R.China;4.Forestry Bureau of Xishuanbanna，Jinhong Yunnan 666100,P.R.China)

Abstract:In order to propagate and cultivate Betula alnoides,taking 22 varieties selected from Simao and Dehong as samples, a study on techniques and relevant measures of tissue culture of Betula alnoides was carried out from sample preparing ,explant differentiation inducting, bud propagating,and root generating.The results showed that the optimum medium for inducing bud differentiation was MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L，with propagating rate of 3 to 6 times, and root medium was 1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L, with rooting rate of 94.4 %.

Key words:Betula alnoide；clone；tisue culture

中圖分類號：S 792.15

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-8246(2015)05-0008-05

作者簡介：第一陳芳(1965-)，女，正高級工程師，主要從事林木組培研究。E-mail：chenfang658@126.com

基金項(xiàng)目：國家林業(yè)局公益性項(xiàng)目(201104060)“西南樺、光皮樺優(yōu)良無性系育林技術(shù)研究”，云南省林業(yè)廳推廣課題“西南樺優(yōu) 良無性系繁育”。

收稿日期：*2015-05-14

doi10.16473/j.cnki.xblykx1972.2015.05.002