張冉冉，連海峰，劉成霞

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濱州 256603

microRNA-486對結(jié)直腸癌裸鼠皮下移植瘤生長抑制作用及其機(jī)制的研究

張冉冉，連海峰，劉成霞

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濱州 256603

背景與目的：越來越多的證據(jù)表明microRNA在生物進(jìn)程的各個階段發(fā)揮重要作用。在不同的惡性腫瘤中microRNA-486表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)，但microRNA-486對人結(jié)直腸癌潛在的作用尚不清楚。該研究旨在探討其對細(xì)胞系SW620裸鼠皮下移植瘤生長情況的影響及其可能的作用機(jī)制。方法：取18只裸鼠，按簡單隨機(jī)法分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白對照組。每組5只，分別皮下接種SW620細(xì)胞。造模成功后實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白對照組每3天分別于瘤周注射miRNA-486過表達(dá)質(zhì)粒、空白載體及等量PBS，比較各組裸鼠皮下瘤體的體積，接種3周后處死裸鼠，取出皮下瘤組織，用免疫組織化學(xué)法和Western blot法分析比較neuropilin-2的表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組瘤體生長速度明顯低于陰性對照組和空白對照組；實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下種植瘤的大小為(0.32±0.12) cm3，陰性對照組為(0.77±0.31) cm3，空白對照組為(0.82±0.18) cm3；實(shí)驗(yàn)組瘤體體積顯著小于其他兩組體積(P=0.006)；實(shí)驗(yàn)組瘤體質(zhì)量為(0.40±0.08) g，明顯低于陰性對照組(0.75±0.18) g及空白對照組(0.79±0.18) g(P=0.008)；實(shí)驗(yàn)組種植瘤中neuropilin-2的表達(dá)量較另外兩組下降(P=0.000)。結(jié)論：注射miR-486過表達(dá)質(zhì)粒后結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620裸鼠皮下移植瘤的生長可受到抑制，其作用可能是通過降低neuropilin-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。miR-486有望成為結(jié)直腸癌治療新的靶點(diǎn)。

miRNA-486；結(jié)直腸腫瘤；神經(jīng)纖毛蛋白-2；移植瘤

結(jié)直腸癌是世界上最常見的病死率較高的惡性腫瘤之一［1］。盡管診斷技術(shù)和治療水平日益提高，但轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是結(jié)直腸癌患者不可避免的結(jié)局［2-3］。因此，盡早地發(fā)現(xiàn)腫瘤并阻斷腫瘤進(jìn)一步發(fā)展是目前研究的熱點(diǎn)。miRNA是一組非編碼小RNA序列，它在調(diào)控基因表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用［4］。既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的各個方面［5］。而我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-486表達(dá)上調(diào)可以削弱結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［6］。本研究旨在通過結(jié)直腸癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立進(jìn)一步探討miR-486在結(jié)直腸癌的演變過程中所發(fā)揮的作用，同時，我們還檢測了各組移植瘤中神經(jīng)氈蛋白-2 (neuropilin-2，NRP2)蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討miR-486在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

實(shí)驗(yàn)中所用的SPF級BALB/c裸鼠購自北京華阜康生物科技有限公司［許可證號：SCXK(京) 2014-0004］，miRNA-486過表達(dá)質(zhì)粒、空白載體由上海吉瑪基因公司構(gòu)建，結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620購自武漢博士德生物工程有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司，兔多克隆NRP2抗體購自英國Abcam公司，miR-486引物購自廣州市銳博生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix試劑盒購自日本TaKaRa公司，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Western blot凝膠試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620用含10%胎牛血清的PMRI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天進(jìn)行換液，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時可進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程在24孔板中進(jìn)行，轉(zhuǎn)染前12 h種板，按照質(zhì)?！弥|(zhì)體0.5∶1、1∶1、1∶2三種比例分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下篩選最佳轉(zhuǎn)染濃度。

1.2.3 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

收集對數(shù)生長期的SW620結(jié)直腸癌細(xì)胞，計(jì)數(shù)后重懸于無血清PMRI1640培養(yǎng)基中，配制成每200 μL含1×107個腫瘤細(xì)胞的懸液。用微量注射器將200 μL細(xì)胞懸液注射于BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩中部背側(cè)皮下。細(xì)胞接種過程需遵循無菌操作原則，避免漏液和污染，接種前30 min需紫外照射操作臺。裸鼠移植瘤長至0.05 cm3時即認(rèn)為造模成功。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組及空白對照組各5只裸鼠，接種7 d后均可在皮下觸到腫瘤長出，造模成功率100%。造模成功后，實(shí)驗(yàn)組每3 d于瘤周注射miRNA-486過表達(dá)質(zhì)粒。陰性對照組注射空載體，空白對照組注射等量PBS［7］。15 d后結(jié)束治療，處死裸鼠，取出皮下瘤體。將部分腫瘤組織放入4%多聚甲醛中4 ℃固定，其余組織放入-80 ℃冰箱中用于之后研究。

1.2.4 腫瘤生長情況的觀察

造模成功后，每3 d測量瘤體最長徑、最短徑，并計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積的計(jì)算公式為：V=l/2 LW2(L為瘤體最長徑，W為瘤體最短徑)，計(jì)算腫瘤體積并繪制生長曲線。接種細(xì)胞第15天時處死裸鼠，取出腫瘤組織測腫瘤質(zhì)量，計(jì)算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=(1-處理組腫瘤質(zhì)量/對照組腫瘤質(zhì)量)×100%。

1.2.5 RT-PCR方法檢測結(jié)直腸癌移植瘤內(nèi)miR-486的表達(dá)水平

從腫瘤組織中提取RNA并測定RNA濃度，當(dāng)RNA的純度在1.8～2.0范圍內(nèi)可進(jìn)行下一步實(shí)

驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄及SYBR實(shí)驗(yàn)步驟按照日本TaKaRa公司試劑盒說明書進(jìn)行，以u6作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 免疫組織化學(xué)和Western blot分別檢測NRP2蛋白的表達(dá)

將組織塊固定常規(guī)石蠟切片，操作步驟按中杉金橋公司免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。NRP2蛋白陽性細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，計(jì)數(shù)5個高倍視野中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)平均陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算IHS評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：A為陽性細(xì)胞數(shù)分級＜1%為0，1%～≤10%為1，＞10～≤50%為2，＞50～≤80%為3，＞80～≤100%為4，B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級0(陰性)、l(弱陽性)、2(陽性)、3(強(qiáng)陽性)IHS=A×B。

從組織中提取蛋白，用組織裂解液裂解腫瘤組織并提取總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度并計(jì)算上樣量，8%聚丙烯凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，7%脫脂奶粉封閉2 h，加入NRP2一抗，4 ℃封閉過夜(1∶800)，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫封閉1 h，洗膜，ECL放射自顯影并計(jì)算灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-486對裸鼠皮下結(jié)直腸癌移植瘤生長的影響

裸鼠皮下接種SW620細(xì)胞后，7 d內(nèi)造模成功率為100%。每3 d測量裸鼠皮下移植瘤體積，繪制移植瘤生長曲線(圖1)。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中裸鼠體積為(0.33±0.04)cm3，而陰性對照組及空白對照組分別為(0.60±0.18)cm3及(0.59±0.21)cm3。實(shí)驗(yàn)組移植瘤生長速度低于陰性對照組和空白對照組，陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。于第3周末取出皮下移植瘤，3組中瘤體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。Tukey檢驗(yàn)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組移植瘤質(zhì)量顯著小于空白對照組［(0.42±0.04) g vs (0.75±0.12)g，Mean Diff.=0.34，P＜0.05］，抑瘤率達(dá)46.67%，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［(0.75±0.12)g vs (0.79±0.18)g，Mean Diff.=0.04，P＞0.05］。

2.2 結(jié)直腸癌皮下移植瘤中miR-486的表達(dá)

采用Tukey檢驗(yàn)方法進(jìn)一步進(jìn)行兩兩組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植瘤中miR-486的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(10.74±0.30 vs 1.00，P＜0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.09±0.23 vs 1.00，P＞0.05)。

圖 1 各組裸鼠胃癌移植瘤生長曲線Fig. 1 Growth curve of tumor volume in mice

2.3 免疫組化方法檢測裸鼠皮下移植瘤中NRP2蛋白的表達(dá)

NRP2蛋白主要定位于結(jié)直腸癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)(圖2)。免疫組織化學(xué)染色可將蛋白染成棕黃色。每張切片中隨機(jī)觀察5個視野并計(jì)算IHS評分，實(shí)驗(yàn)組得分為2.20±0.84，而陰性對照組及空白對照組得分分別為6.40±0.89、6.20±1.48。實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組和空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞ 0.05)。

2.4 Western blot測定NRP2蛋白在結(jié)直腸癌裸鼠皮下移植瘤中的表達(dá)

NRP2蛋白在各組中表達(dá)情況見圖3。蛋白表達(dá)量計(jì)算經(jīng)GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)組移植瘤中NRP2的相對表達(dá)量較陰性對照組及空白對照組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，而陰性對照組及空白對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖 3 各組結(jié)直腸癌裸鼠皮下移植瘤NRP2表達(dá)情況Fig. 3 The expression of NRP2 in subcutaneously xenografted colorectal carcinoma in nude mice

圖 2 移植瘤組織中NRP2蛋白的分布情況Fig. 2 The distribution of NRP2 protein in xenographed tumor tissues

3 討 論

隨著人類對分子生物學(xué)研究的不斷深入，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)、了解。以miRNA作為腫瘤學(xué)標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的新思路、新方法已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。miR-486是目前研究較為深入的miRNA。Oh等［8］發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中miR-486會表達(dá)下調(diào)，抑制miR-486的表達(dá)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。此外，Peng等［9］體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明，上調(diào)miR-486的表達(dá)能夠降低肺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，同時能夠抑制肺癌腫瘤的生長。Zhang等［10］研究也證實(shí)miR-486可在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤模型來研究miR-486在結(jié)直腸癌細(xì)胞生長、增殖中的作用。實(shí)驗(yàn)組我們注射miR-486的過表達(dá)質(zhì)粒，對照組分別采用陰性對照組和空白對照組，陰性對照組注射空載體質(zhì)粒，有效地排除了注射載體對實(shí)驗(yàn)的影響，而空白對照組我們注射的是等量的PBS，排除了細(xì)胞培養(yǎng)和腫瘤生長中各種不可避免因素的影響，這樣，實(shí)驗(yàn)組各組之間的差異我們可以歸結(jié)于是miR-486對腫瘤的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-486后，實(shí)驗(yàn)組miR-486的表達(dá)豐度可上調(diào)10倍左右，同時腫瘤體積明顯小于其他兩組，抑瘤率可達(dá)46.67%。此外，我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-486可在轉(zhuǎn)錄后水平上直接抑制NRP2的表達(dá)，NRP2首次作為軸突導(dǎo)向分子被發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。而近年來，NRP2被發(fā)現(xiàn)在胃癌［11］和結(jié)直腸癌［12］的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但NRP2是否對腫瘤的

生長有影響目前鮮有研究。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)瘤周注射miRNA-486治療后，免疫組織化學(xué)及Western blot實(shí)驗(yàn)均能發(fā)現(xiàn)NRP2的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，而腫瘤的體積、重量明顯下降，這說明miR-486可能是通過降低NRP2的表達(dá)從而抑制腫瘤的生長。

綜上所述，本研究證明miR-486可以抑制結(jié)直腸癌腫瘤的生長，而這一作用可能與抑制NRP2蛋白的表達(dá)有關(guān)，因此，miR-486有望成為結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)。

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Inhibitory effect of miR-486 on xenografted human colorectal carcinoma growth and its possible mechanism

ZHANG Ranran, LIAN Haifeng, LIU Chengxia (Department of Gastroenterology, Binzhou

Medical University Hospital, Binzhou 256603, Shandong, China)

LIU Chengxia E-mail: phdlcx@163.com

Background and purpose: This study was to investigate the effect of miRNA-486 on the growth of human colorectal cancer cell line SW620 xenograft in nude mice and to explore the possible mechanism of action. Methods: Eighteen mice were randomly divided into three groups, including the experimental group, the negative control group and the blank control group. Each group contained 6 mice. The SW620 cell line was inoculated subcutaneously into nude mice to establish the model of human colorectal cancer xenografts. Peritumoral injection of miRNA-486 overexpression plasmid, or blank vector and PBS were performed every 3 days. The volumes of subcutaneous tumors in each group of inoculated mice were compared. Then mice were sacrificed 3 weeks after infection. Immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expression of neuropilin-2 (NRP2). Results: The growth rate of tumors in the experimental group was significantly lower than that in the negative control group and the blank control group. After 21 days, the size of transplanted tumors in the experimental group nude mice was (0.32±0.12) cm3, that in the negative control group was (0.77±0.31) cm3, and that in blank control group was (0.82±0.18) cm3. Tumor mass in the experimental group was significantly smaller than that in the other two groups (P=0.006＜0.05). Tumor mass in the experimental group was (0.40±0.08) g, significantly smaller than that in the negative control group (0.75±0.18) g and in the blank control group (0.79±0.18) g (P=0.008＜0.05). Compared with the expression of NRP2 in other groups, the growth of tumor in the experimental group declined (P=0.000＜0.05). Conclusion: Colorectal cancer cell line SW620 xenografted tumor in nude mice can be suppressed after injection of miR-486, which may decrease the expression of NRP2.

miRNA-486；Colorectal cancer；Neuropilin -2 (NRP2); Xenografted tumor

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.10.008

R735.3+5；R735.3+7

A

1007-3639(2015)10-0802-05

2015-06-30

2015-09-07）

山東省自然科學(xué)基金(ZR2014HQ072)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃(2014WS0490)；濱州市科技發(fā)展計(jì)劃(2014ZC0116)。

劉成霞 E-mail:phdlcx@163.com