劉 紅，王玉凈，邊 磊，黎海莉，房朝暉，吳小華，程建新

1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦瘤科，河北 石家莊 050011；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050011；

3.白求恩國(guó)際和平醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050082

CD44+/CD24+表型的宮頸癌Siha細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥及機(jī)制研究

劉 紅1，王玉凈2，邊 磊2，黎海莉2，房朝暉1，吳小華3，程建新2

1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦瘤科，河北 石家莊 050011；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050011；

3.白求恩國(guó)際和平醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050082

背景與目的：腫瘤干細(xì)胞的存在是腫瘤細(xì)胞抗拒化療的原因之一。該研究探討CD44+/CD24+宮頸癌Siha細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性及相關(guān)機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)Siha細(xì)胞，流式熒光激活細(xì)胞分選儀分選CD44+/ CD24+Siha細(xì)胞，噻唑藍(lán)(thiazolyl blue，MTT)法檢測(cè)不同濃度順鉑對(duì)細(xì)胞的體外抑制情況，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)10 μg/mL順鉑作用于CD44+/CD24+Siha細(xì)胞24、48和72 h時(shí)的細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitutive real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)CD44+/CD24+Siha細(xì)胞中Oct-4、ABCG2、Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)設(shè)立親代Siha細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果：不同濃度順鉑(0.1、1、5、10、15和20 μg/mL)對(duì)CD44+/CD24+Siha細(xì)胞的增殖抑制作用較親代Siha細(xì)胞?。?88.4±1.5)% vs (92.9±1.5)%，(79.9±1.0)% vs (84.7±1.1)%，(69. 8±0.8)% vs (75.1±2.9)%，(59.0±0.7)% vs (65.8±2.7)%，(49.6±0.9)% vs (52.1±0.5)%，(45.1±0.7)% vs (48.8±1.0)%，P＜0.05］；與親代細(xì)胞相比，當(dāng)10 μg/mL順鉑作用于CD44+/CD24+Siha細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)在24、48和72 h時(shí)的細(xì)胞凋亡率均較?。?3.05±0.16)% vs (5.17±0.27)%，(17.94±2.02)% vs (32.60±4.28)%和(40.14±3.01)% vs (56.62±5.32)%，P＜0.05］。qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)均顯示CD44+/ CD24+Siha細(xì)胞高表達(dá)Oct-4、ABCG2和Bcl-2，與親代Siha細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。結(jié)論：CD44+/ CD24+Siha細(xì)胞可以抵抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，具有化療抵抗性，并且高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物如Oct-4和ABCG2，該結(jié)果在宮頸癌腫瘤干細(xì)胞的有效分選以及腫瘤靶向治療方面有深遠(yuǎn)意義。

宮頸癌；腫瘤干細(xì)胞；CD44+；CD24+；順鉑；耐藥；凋亡

宮頸癌在我國(guó)婦女惡性腫瘤中的發(fā)病率及病死率均僅次于乳腺癌，位居第二位，是一種嚴(yán)重危害著廣大女性身體健康的惡性腫瘤［1］。近年來(lái)，隨著宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查、HPV(人乳頭狀瘤病毒)檢測(cè)及陰道鏡病理活檢的廣泛應(yīng)用，我國(guó)在宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療方面均取得了很大進(jìn)展，但晚期宮頸癌及復(fù)發(fā)性宮頸癌對(duì)放化療不敏感、治療效果差仍是宮頸癌治療中急需解決的難題。腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤組織中具有自我更新和多向分化潛能的一小部分干細(xì)胞樣細(xì)胞，在腫瘤發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中均起著關(guān)鍵作用［2］。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)治療方法的抵抗可以解釋治療失敗的原因，雖然放化療可以殺滅絕大部分腫瘤，但不能防止殘存的腫瘤干細(xì)胞會(huì)繼續(xù)發(fā)生作用［3］。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)耐放療宮頸癌Siha細(xì)胞系中CD44+/CD24+細(xì)胞所占比例明顯增高，基于此，本研究擬探討CD44+/CD24+Siha細(xì)胞的順鉑耐藥性及其細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)情況，旨在明確CD44+/CD24+Siha細(xì)胞是否具有抵抗順鉑引起的細(xì)胞凋亡和高表達(dá)Oct4、ABCG2腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物的特性。

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑

RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)購(gòu)自北京索來(lái)寶公司，Anti-Human/ Mouse CD44 PE、Rat IgG2b K control PE、Anti-Human CD24 FITC、FITC Mouse IgG1K Isotype Control 均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，MTT購(gòu)自德國(guó)Sigma公司，DMSO購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，Redzol(一步法總RNA提取試劑)購(gòu)自北京賽百盛生物技術(shù)公司，超純RNA提取試劑盒 CWbio. Co. Ltd (Cat# CW0581)、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒 CWbio. Co. Ltd (Cat# CW0744)、UltraSYBR Mixture(With ROX) CWbio. Co. Ltd (Cat# CW0956)、5×RNA Loading Buffer CWbio. Co. Ltd (Cat# CW0611A)、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒購(gòu)自中國(guó)Fermentas公司，兔抗人Oct-4 多克隆抗體、兔抗人ABCG2 多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Bioward公司，β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，瓊脂糖購(gòu)自北京凌飛科技有限公司，DEPC購(gòu)自北京賽百盛生物技術(shù)公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Gentest公司，低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Gentest公司，PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海晶美生物公司，Oct-4、ABCG2、Bcl-2、GAPDH引物均購(gòu)自上海捷瑞技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞及其培養(yǎng)

人宮頸癌Siha細(xì)胞株(鱗癌)由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心細(xì)胞庫(kù)饋贈(zèng)。用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 流式熒光激活細(xì)胞分選儀(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)分選CD44+/CD24+表達(dá)陽(yáng)性Siha細(xì)胞

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Siha細(xì)胞，用0.25%的胰

蛋白酶-0.02%EDTA消化并機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液，167.85×g離心5 min去除細(xì)胞碎片，PBS洗滌2次，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，以PBS調(diào)整細(xì)胞密度為每管1×104/μL，抗體置于冰上保存，按產(chǎn)品說(shuō)明書，分別加入CD44-anti-PE (0.625 μL/test)和CD24-anti-FITC(0.25 μL/test)抗體，同時(shí)每種抗體設(shè)同型對(duì)照，常溫避光溫育30 min，167.85×g離心5 min去上清液，PBS至少洗2次，200目細(xì)胞網(wǎng)篩過(guò)濾，加入500 μL PBS液重懸，上機(jī)。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

將分選的CD44+/CD24+Siha細(xì)胞重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為 5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。然后置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，每組分別加入含不同質(zhì)量濃度順鉑(0.1、1、5、10、15、20 μg/mL)和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL。移入培養(yǎng)箱中，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，每孔加入20 μL MTT液(5 g/L)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上層培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO液，置于振蕩儀上室溫振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處的吸光度值(D值)，以只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔調(diào)零。同時(shí)設(shè)立親代Siha細(xì)胞為對(duì)照組。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率= D加藥組/ D對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率

將分選的CD44+/CD24+Siha細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%密度，同步化培養(yǎng)24 h，再更換為用3%胎牛血清稀釋最終順鉑質(zhì)量濃度為10 μg/mL的培養(yǎng)基，同時(shí)以未加順鉑的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組，分別在24、48、72 h后收集細(xì)胞于離心管中，167.85×g離心5 min，棄上清液，預(yù)冷的PBS洗滌2次后，用-20 ℃的75%乙醇固定，于4 ℃放置備用。測(cè)定前用4 ℃ PBS洗細(xì)胞2次，RNA酶(終質(zhì)量濃度為50 μg/mL)消化，加PI染液(終質(zhì)量濃度為50 μg/mL)1 mL，室溫避光染色30 min。300目尼龍膜過(guò)濾后流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國(guó)BD公司)檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立親代Siha細(xì)胞為對(duì)照組。每組重復(fù)3次。用CellQuest軟件分析SubG1峰。

1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR)實(shí)驗(yàn)

用TRIzol法分別提取CD44+/CD24+Siha細(xì)胞、親代Siha細(xì)胞的總RNA行qRT-PCR。20 μL的反應(yīng)體系為：2×UltraSYBR Mixture：10 μL，上游引物(10 μm/μL)：0.4 μL，下游引物(10 μm/μL)：0.4 μL，模板(cDNA)：2 μL，DEPC ddH2O：7.2 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s；60 ℃20 s，共循環(huán)45次。數(shù)據(jù)收集及分析采用Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1序列檢測(cè)系統(tǒng)?！鰿t值是每個(gè)樣本目的基因的循環(huán)閾值(Ct)與內(nèi)參Ct的差異，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用?Ct(Ct目的-Ct內(nèi)參)法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以2-?Ct×104作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表 1 各qRT-PCR引物及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab. 1 The sequences for the primers of qRT-PCR

1.7 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上放置15 min后，24 170.4×g離心15 min，取上清液，紫外分光光度計(jì)定量后置-80 ℃?zhèn)溆?。灌?0% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，兔抗人Oct-4、ABCG2、Bcl-2多克隆抗體，用PBST稀釋，稀釋比為l∶300，β-actin抗體稀釋比為1∶5 000，4 ℃過(guò)夜；PBST洗膜3次，二抗(1∶2 000)，室溫溫育 1 h，ECL顯色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Levene檢驗(yàn)，方差不等用t’檢驗(yàn)，各組間多個(gè)均數(shù)比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)結(jié)果

不同濃度順鉑作用于CD44+/CD24+Siha和親代Siha細(xì)胞時(shí)，兩組細(xì)胞存活率均隨順鉑劑量的增加而減小。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)兩組細(xì)胞分別給予順鉑0.1、1、5、10、15、20 μg/mL作用24 h后發(fā)現(xiàn)，相同的藥物濃度作用相同時(shí)間內(nèi)，順鉑對(duì)CD44+/CD24+Siha細(xì)胞存活率影響較對(duì)親代Siha細(xì)胞的小。兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中10 μg/mL順鉑作用兩組細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率差異最大，CD44+/ CD24+Siha組為(65.79±2.71)%，親代Siha細(xì)胞組為(58.97±0.70)%(圖1，P=0.042)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

10 μg/mL順鉑分別作用于CD44+/CD24+Siha細(xì)胞和親代Siha細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀在24、48和72 h時(shí)測(cè)得細(xì)胞凋亡率分別為(3.05±0.16)%、(5.17±0.27)%、(17.94±2.02)%、(32.60±4.28)%和(40.14±3.01)%、(56.62±5.32)%。兩組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043、0.008、0.012，圖2)。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

CD44+/CD24+Siha細(xì)胞和親代Siha細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是34.34±5.25、2.23±0.16，兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；Oct-4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是30.16±6.35、2.79±0.75，兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；ABCG2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是41.26±7.23、4.23±1.12，兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，圖3)。

圖 1 順鉑對(duì)CD44+/CD24+Siha和Siha細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effects of DDP on cell survival rates of CD44+/CD24+Siha cells and Siha cells

圖 2 順鉑對(duì)CD44+/CD24+Siha和Siha細(xì)胞凋亡率的影響Fig. 2 Effects of DDP on cell apoptotic rates of CD44+/CD24+Siha cells and Siha cells

圖 3 CD44+/CD24+Siha和Siha細(xì)胞中Bcl-2、Oct-4和ABCG2 mRNA表達(dá)的影響Fig. 3 The expressions of Bcl-2, Oct-4 and ABCG2 mRNA in CD44+/CD24+Siha cells and Siha cells

2.4 Western blot檢測(cè)

采用Western blot檢測(cè)CD44+/CD24+Siha細(xì)胞和Siha細(xì)胞中Bcl-2、Oct-4和ABCG2蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在CD44+/CD24+Siha細(xì)胞中Bcl-2、Oct-4和ABCG2蛋白的表達(dá)均較Siha細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖 4 Bcl-2、Oct-4和ABCG2蛋白在CD44+/CD24+Siha細(xì)胞和Siha細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 4 The expressions of Bcl-2, Oct-4 and ABCG2 in CD44+/ CD24+Siha cells and Siha cells

3 討 論

宮頸癌傳統(tǒng)治療方法早期以手術(shù)治療為主，中晚期以放射治療為主。研究表明，盡管以順鉑為基礎(chǔ)的同步放化療在早期高危宮頸癌、中晚期宮頸癌及復(fù)發(fā)性宮頸癌的治療中療效明顯［4-6］，但仍有部分宮頸癌患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其主要原因是在治療過(guò)程中，宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療和放療產(chǎn)生了原發(fā)性或繼發(fā)性抵抗，從而導(dǎo)致患者預(yù)后不良。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，在腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系中存在一小部分具有自我更新、多向分化潛能的細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起主要作用，并抵抗放化療［7］。這說(shuō)明宮頸癌細(xì)胞抵抗放化療的機(jī)制可能與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。

本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耐放療宮頸癌Siha細(xì)胞系中CD44+/CD24+細(xì)胞所占比例增高，我們采用流式細(xì)胞分選儀分選得到CD44+/CD24+Siha細(xì)胞，利用MTT法測(cè)得順鉑可以不同程度抑制兩組細(xì)胞的體外增殖且有一定的量效關(guān)系。當(dāng)相同濃度的順鉑分別作用于CD44+/CD24+Siha細(xì)胞和其親代細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)CD44+/CD24+Siha細(xì)胞存活率的影響較對(duì)親代Siha細(xì)胞小，表明CD44+/CD24+Siha細(xì)胞對(duì)順鉑有一定抵抗性。將10 μg/mL順鉑作用于兩組細(xì)胞，分別在24、48和72 h時(shí)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示順鉑對(duì)兩組細(xì)胞凋亡率的影響均隨時(shí)間遞增而增強(qiáng)，表明順鉑對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響有一定的時(shí)間依賴性；但同一濃度順鉑在相同時(shí)間內(nèi)對(duì)CD44+/CD24+Siha細(xì)胞凋亡率的影響較親代Siha細(xì)胞的小，說(shuō)明CD44+/CD24+Siha細(xì)胞可以抵抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2是重要的抗凋亡基因之一，其作用機(jī)制是抑制線粒體中細(xì)胞色素c的釋放，并使凋亡蛋白前體Apaf-1固定于線粒體膜上來(lái)阻斷Caspase通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［8-9］。本實(shí)驗(yàn)從基因水平和蛋白水平檢測(cè)兩組細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果顯示與親代Siha細(xì)胞相比，Bcl-2在CD44+/CD24+Siha細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯上調(diào)。

Oct-4屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族，是維持腫瘤干細(xì)胞自我更新、多向分化潛能的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。許多研究已證實(shí)Oct-4存在于多種不同類型的腫瘤干細(xì)胞中［10］。曹浩哲等［11］研究顯示，Oct-4在正常宮頸組織中幾乎不表達(dá)，但在宮頸癌組織中表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的分化程度呈負(fù)相關(guān)。目前已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Oct-4基因可以引發(fā)腫瘤細(xì)胞去分化，促使向腫瘤干細(xì)胞方向發(fā)展，敲除未分化細(xì)胞的Oct-4基因后

腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物及其獲得的干細(xì)胞特性會(huì)明顯減少。類似結(jié)論已在黑素瘤、頭頸鱗癌研究中得到證實(shí)［12-13］。ATP-bingding cassette transporter G2 subfamily三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ABCG2)，是一類跨膜蛋白，主要分布于某些腫瘤和干細(xì)胞胞膜中，具有排除細(xì)胞毒性物質(zhì)的能力，進(jìn)而產(chǎn)生抗化療的效應(yīng)，是腫瘤干細(xì)胞耐藥的主要原因［14］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中Oct-4和ABCG2的表達(dá)，結(jié)果顯示CD44+/CD24+Siha細(xì)胞較親代Siha細(xì)胞高表達(dá)Oct-4和ABCG2。CD44+/ CD24+Siha細(xì)胞抗拒順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與CD44+/CD24+Siha細(xì)胞高表達(dá)Bcl-2基因和ABCG2基因有關(guān)，而CD44+/CD24+Siha細(xì)胞高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞樣表面標(biāo)志物Oct-4，說(shuō)明其可能具備部分腫瘤干細(xì)胞的特性，而CD44+/CD24+是否為宮頸癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物還有待進(jìn)一步研究。

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Study on the chemoresistance of CD44+/CD24+Siha cells to cisplatin and its mechanisms

LIU Hong1,

WANG Yujing2, BIAN Lei2, LI Haili2, FANG Zhaohui1, WU Xiaohua3, CHENG Jianxin2(1.Department of Gynecological Tumor, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei, China; 3.Department of Obstetrics and Gynecology, Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, Hebei, China)

CHENG Jianxin E-mail: jianxin_cheng@263.net

Background and purpose: One of the reasons why cancer cells are resistant to chemotherapy is the existence of cancer stem cells. The purpose of this study was to investigate the chemoresistance of CD44+/CD24+Siha cells to cisplatin and its mechanisms. Methods: Siha cells were cultivated in vitro. The CD44+/CD24+Siha cells were sorted out by fluorescence activated cell sorter (FACS) and in vitro proliferation was detected by MTT assay after treatment with the different concentrations of cisplatin. The cell apoptosis rate was detected by flow cytometry after 10 μg/mL cisplatin acted on CD44+/CD24+Siha cells for 24, 48 and 72 h. The relative mRNA and protein expressions of Bcl-2, Oct-4 and ABCG2 were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot, respectively. Results: The survival rates of CD44+/CD24+Siha cells treated with different concentrations of cisplatin (0.1, 1, 5, 10, 15 and 20 μg/mL) were higher than those of their parental Siha cells [(88.42±1.51)% vs (92.87±1.5)%, (79.94±1.05)%

Cervical cancer; Cancer stem cells; CD44+; CD24+; Cisplatin; Drug resistance; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.10.005

R737.33；R73-36+1

A

1007-3639(2015)10-0785-06

2015-07-06

2015-08-29）

河北省科技支撐計(jì)劃(14277770D)；河北省杰出青年科學(xué)基金 (C2010002011)。

程建新 E-mail:jianxin_cheng@263.net

vs (84.72±1.09)%, (69.78±0.81)% vs (75.13±2.86)%, (58.97±0.70)% vs (65.79±2.71)%, (49.60±0.88)% vs (52.10±0.52)%, (45.13±0.69)% vs (48.84±1.02)%, P＜0.05]. Compared with their parental Siha cells, the apoptosis rates of CD44+/CD24+Siha cells were lower after 10 μg/mL of cisplatin acting on them for 24, 48 and 72 h, respectively [(3.05±0.16)% vs (5.17±0.27)%, (17.94±2.02)% vs (32.60±4.28)% and (40.14±3.01)% vs (56.62±5.32)%, P＜0.05]. The results from both qRT-PCR and Western blot indicated that Oct-4, ABCG2 and Bcl-2 were highly expressed on CD44+/CD24+Siha cells. A significant difference was found in Oct-4, ABCG2 and Bcl-2 expression between CD44+/CD24+Siha cells and their parental cells (P=0.015＜0.05). Conclusion: CD44+/CD24+Siha cells could be resistant to apoptosis induced by cisplatin and expressed high levels of cancer stem cell markers such as Oct-4 and ABCG2. This study lays the basis for useful isolation and further targeted therapy of cervical cancer stem cells.