段艷紅，文 博

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系，河南 新鄉(xiāng) 453000;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 漢口430030)

細(xì)胞色素P450(CYP)是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族(superfamily)基因編碼的同功酶(isozyme)，因與 CO結(jié)合后對(duì)450nm波長(zhǎng)有很強(qiáng)的吸收峰而得名。實(shí)際上，它屬于血紅蛋白類(lèi)酶，是微粒體混合功能氧化酶系中最重要的一類(lèi)氧化酶，分布于生物的多種組織、器官中，它參與內(nèi)源性生物活性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化。它在生物的新陳代謝、選擇進(jìn)化、生物與環(huán)境的互動(dòng)、生物防治、環(huán)境保護(hù)、動(dòng)植物基因工程(genetic engineering)和醫(yī)藥衛(wèi)生方面均起到比較重要的作用，因此，它不僅具有理論意義，而且也有一定的實(shí)際價(jià)值。

1 細(xì)胞色素P450的種類(lèi)

細(xì)菌是P450起源的領(lǐng)地，P450進(jìn)化的確切時(shí)間和進(jìn)化途經(jīng)現(xiàn)在還不清楚，但它肯定是出現(xiàn)于大氣氧分子存在以前。

真菌P450可歸為4個(gè)集團(tuán)，還有幾個(gè)未被歸入的集團(tuán)序列。52集團(tuán)有3個(gè)家族(CYP52，63，505)，53集團(tuán)有 7個(gè)家族(CYP52，57，507，65，60，62，58)，54集團(tuán)有5個(gè)家族(CYP54，506，68，69，503)，64集團(tuán)有5個(gè)家族(CYP64，66，501，502，504)，另外一些家族不能歸在以上任何集團(tuán)，即CYP51，56，61和67。真菌 P450已知序列有限，對(duì)其功能的了解也不充分。

植物P450可以分為4個(gè)集團(tuán)，最大的一個(gè)被稱(chēng)為 A組植物P450集團(tuán)，亦成為71集團(tuán)。已知的47個(gè)植物P450家族中有25個(gè)歸于這個(gè)集團(tuán)。另外三個(gè)集團(tuán)分別為72集團(tuán)含CYP72，709，714，715 家 族;85 集 團(tuán) 含 CYP85，87，88，90，702，707，708，716，718，;86 集團(tuán)含 CYP86，94，96 和 704。而植物體的 CYP51，74，97，710和 711家族在這些集團(tuán)外。另外CYP74家族的P450異常。其螺旋I的序列不保守。

43個(gè)動(dòng)物P450家族可以較好的聚集成集團(tuán)。在人類(lèi)P450基因已經(jīng)有17個(gè)家族。人類(lèi)和小鼠分別定位20個(gè)和15個(gè)CYP450基因亞家族。線(xiàn)蟲(chóng)集團(tuán)成員較純，僅包含來(lái)自Caenorhabditis elegans的序列，它可能與2個(gè)集團(tuán)有共同祖先，這兩個(gè)集團(tuán)可能看成超集團(tuán)。3集團(tuán)包括哺乳動(dòng)物的CYP3和 CYP5，昆 蟲(chóng)的 CYP6，CYP9，CYP28，C.elegans的CYP13和 CYP30，龍蝦的 CYP45。

2 細(xì)胞色素P450的分布

細(xì)胞色素 P450存在于不同的生物(細(xì)菌、真菌、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物)和生物的不同組織中。其中脊椎動(dòng)物肝臟中細(xì)胞色素 P450含量最豐富，皮膚、肺、消化道等器官的入口處及腎、腎上腺、睪丸、卵巢、主動(dòng)脈和血小板等也存在細(xì)胞色素P450。昆蟲(chóng)的許多組織和器官如中腸、脂肪體、馬氏管甚至頭殼中都發(fā)現(xiàn)有P450。細(xì)胞色素P450主要分布于外源物進(jìn)入體內(nèi)必經(jīng)的組織器官，構(gòu)成外源物進(jìn)入體內(nèi)的第一道防線(xiàn)，如在哺乳動(dòng)物中，它主要分布于皮膚、大腦、肺、胃腸道、肝臟、腎臟、腎上腺、睪丸、胎盤(pán)、黃體、主動(dòng)脈、血小板和巨噬細(xì)胞等;在魚(yú)類(lèi)中，它主要分布于肺、腎和鰓;在昆蟲(chóng)中，多存在于中腸、脂肪體和馬氏管中，而以中腸含量最高[1，2]。高等植物的細(xì)胞色素 P450分布在質(zhì)膜、微粒體和高爾基體等處。

3 細(xì)胞色素P450的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制

通常 P450有4個(gè) β折疊，13個(gè) α－螺旋，其中 β5是可變的。核心區(qū)域較保守，由 D、E、I、J、K和 L 6個(gè) α螺旋組成。螺旋I包含高度保守的蘇氨酸，N－端有酸性氨基酸殘基，位于活性中心吡咯環(huán)B的上方。螺旋K含非常保守的 E－X－X－R，可能起穩(wěn)定核心結(jié)構(gòu)的作用，位于血紅素近側(cè)。螺旋L構(gòu)成血紅素結(jié)合區(qū)的一個(gè)部分，有兩套結(jié)構(gòu)保守的 β－折疊，一為 β－折疊1，包含5個(gè)股;另一為 β折疊2，包含2個(gè)股。這些折疊有助于形成疏水性的底物進(jìn)入通道。P450的結(jié)構(gòu)保守的共有序列位于血紅素的近表面，含高度保守的半胱氨酸cysteine(cys)，它是血紅素鐵的第5個(gè)配體。線(xiàn)粒體P450 L－螺旋區(qū)包含2個(gè)帶正電荷的氨基酸(通常為精氨酸)殘基[3]。近表面還有一卷曲稱(chēng)為絆，結(jié)構(gòu)高度保守，以前稱(chēng)為芳香區(qū)[4]。

細(xì)胞色素P450位于電子傳遞系統(tǒng)的中心，當(dāng)體內(nèi)不需要的一些分子，如毒素和藥物分子隨營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，體內(nèi)沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的系統(tǒng)來(lái)排泄這些富含碳原子的外來(lái)分子，于是細(xì)胞色素P450添加一個(gè)化學(xué)基團(tuán)附著到這些分子上，隨后，其它酶也將一些化學(xué)基團(tuán)添加于這些分子上，使外來(lái)分子成為水溶性分子，易于通過(guò)膽汁、尿液或糞便等途徑排出體外。細(xì)胞色素P450和有關(guān)酶主要存在于肝臟中，在那里他們形成了第一道防御外來(lái)毒素的防線(xiàn)。它們?cè)诒钦衬ぶ幸财毡榇嬖?，使機(jī)體免受有毒氣體的損害[5]。

細(xì)胞色素P450催化的主要反應(yīng)有烷基的羥基化，烷基的環(huán)氧化，羥基的氧化，氨氧硫部位上的脫烷基化，氨部位上的羥基化和氧化，硫部位上的氧化、氧化性脫氨、脫氫和脫鹵素，氧化性的C－C斷裂以及一些還原催化反應(yīng)等。

細(xì)胞色素P450的催化循環(huán)機(jī)制:

1)細(xì)胞色素P450與底物的總反應(yīng)可用下式表示

RH代表產(chǎn)物，在催化反應(yīng)過(guò)程中分子氧裂解而形成水合羥基化的代謝產(chǎn)物(ROH)。反應(yīng)中需要兩個(gè)電子和兩個(gè)質(zhì)子。在線(xiàn)粒體和許多細(xì)菌中，電子是從 NADH或 NADPH通過(guò)依賴(lài)FAD還原酶?jìng)鬟f到鐵－硫鐵氧還蛋白，然而在微粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)中，NADPH傳遞電子是通過(guò)含黃素蛋白的FAD和FMN，即細(xì)胞色素P450還原酶，無(wú)需 Fe2S2氧還蛋白的中介作用，而b5也可能是提供第二個(gè)電子的來(lái)源[6]。

2)催化步驟

(1)底物與P450酶的結(jié)合

已知靜態(tài)的酶主要以低自旋高鐵型、水分子占據(jù)血紅素袋的形式存在，可能是一個(gè)水分子與血紅素的鐵絡(luò)合細(xì)胞色素P450與底物結(jié)合，親和性強(qiáng)，結(jié)合迅速，并伴隨光譜的變化，這表明鐵自旋平衡態(tài)變?yōu)楦咦孕龖B(tài)，底物的結(jié)合降低了細(xì)胞色素P450的氧化還原電位，而相對(duì)穩(wěn)定的底物－結(jié)合復(fù)合體就容易還原為 Fe(Ⅱ)態(tài)，這樣易于電子從黃素蛋白還原酶或鐵－硫氧化還原蛋白傳遞。底物的結(jié)合可能是引發(fā)細(xì)胞色素P450循環(huán)催化的關(guān)鍵階段。隨著底物的結(jié)合后，下一步是細(xì)胞色素P450通過(guò)結(jié)合氧化還原配體進(jìn)行單個(gè)電子還原作用[7]。

(2)第一次還原作用

在細(xì)胞色素P450循環(huán)催化過(guò)程中，第一個(gè)電子從還原酶或鐵硫蛋白傳遞是相當(dāng)迅速的[8]。這期間可分為三個(gè)階，即電子從NAD(P)H傳遞到還原酶;從還原酶到鐵硫蛋白;從鐵硫蛋白到細(xì)胞色素P450分子。在微粒體系統(tǒng)沒(méi)有中間的鐵硫蛋白，而是含F(xiàn)AD和FMN的還原酶直接將電子傳遞到細(xì)胞色素P450。

(3)氧的結(jié)合

底物結(jié)合細(xì)胞色素P450并發(fā)生還原作用后，第二步是分子氧迅速與高自旋 Fe(Ⅱ)P450－底物復(fù)合體結(jié)合。產(chǎn)生的氧化亞鐵復(fù)合體相當(dāng)穩(wěn)定，自動(dòng)氧化為超氧化物。有研究證明，細(xì)胞色素P450氧化亞鐵復(fù)合體變?yōu)楦哞F超氧化物導(dǎo)致電子由鐵傳遞到分子氧[9]。氧化的細(xì)胞色素 P450復(fù)合體的自氧化作用生成超氧化物，在重組的微粒體系統(tǒng)，細(xì)胞色素P450形成了兩個(gè)不同的復(fù)合體。

(4)第二次還原作用

在催化反應(yīng)中，進(jìn)入第二個(gè)還原當(dāng)量從總動(dòng)力學(xué)考慮它決定反應(yīng)速度步驟。此為氧化細(xì)胞色素P450－底物復(fù)合體分解的主要途徑。Gibson and Tamburini證明，細(xì)胞色素b5能調(diào)節(jié)第2個(gè)電子傳遞到加氧的細(xì)胞色素P450復(fù)合體上，電子從NADH通過(guò)細(xì)胞色素b5還原酶?jìng)鬟f到細(xì)胞色素b5的速度常數(shù)為30/S，在從細(xì)胞色素b5傳遞到細(xì)胞色素 P450為2～7/S。電子從NADPH通過(guò)它的還原酶?jìng)鬟f到細(xì)胞色素P450的速度常數(shù)是1.1/S。雙氧鍵的伸延和變?nèi)跻子诹呀?，裂解后一個(gè)氧原子進(jìn)入底物另一個(gè)氧原子在重排過(guò)程中得到兩個(gè)質(zhì)子后形成水分子，細(xì)胞色素P450將進(jìn)行下一次催化循環(huán)[10]。

(5)產(chǎn)物的形成

加氧的還原P450－底物復(fù)合體分解形成總催化反應(yīng)產(chǎn)物的過(guò)程還不是很清楚。關(guān)于鐵過(guò)氧復(fù)合體的分解，形成已知產(chǎn)物的機(jī)制已有很多報(bào)道。

4 P450酶的檢測(cè)方法

4.1 酶的藥物代謝活力

P450酶是一類(lèi)藥物代謝酶，所以可以通過(guò)人體攝入一定量的某種藥物，檢測(cè)其體液中代謝產(chǎn)物的含量確定酶活性的大小，例如P450ЦD1酶的EM、PM性別判定。這種方法只能確定只能確定蛋白活性而不能檢測(cè)基因是否存在突變。

4.2 免疫組化方法

以特定基因結(jié)構(gòu)的抗體識(shí)別相應(yīng)抗原而檢測(cè)酶在不同組織中的表達(dá)情況，但可能存在非特異性的交叉反應(yīng)會(huì)造成誤差。

4.3 分子生物學(xué)方法

常用的是 PCR方法和 RFLP－PCR(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)方法，RFLP－PCR是對(duì)相同引物擴(kuò)增的片段用限制酶切后，以DNA片段的長(zhǎng)度差異檢測(cè)基因的突變情況，這種方法簡(jiǎn)單、精確，因此常用，最近 RFLP－PCR在研究細(xì)胞色素P450基因方面應(yīng)用最多。另外，直接DNA測(cè)序是最直接準(zhǔn)確的檢測(cè)基因突變的方法，但費(fèi)用高，程序復(fù)雜，較少應(yīng)用[11]。

5 哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素P450及其功能

哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素 P450酶系的生物功能廣泛，它可以對(duì)大量的內(nèi)源化合物如甾類(lèi)化合物、膽酸、脂肪酸、前列腺素、白細(xì)胞三烯以及生物胺等進(jìn)行氧化、過(guò)氧化以及還原代謝作用。此酶系還能代謝范圍很廣的外源化合物，包括藥物、環(huán)境污染物和醇類(lèi)。外源化合物的代謝可能產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，有些代謝產(chǎn)物可能誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生與發(fā)展，下表列舉了部分P450及其催化的反應(yīng)。

表1 部分P450基因型和催化反應(yīng)(modified from Strobel et al. ，1997)

作用

由表1可以看出，多型的細(xì)胞色素P450能有效的交替催化代謝。少數(shù)底物對(duì)某異構(gòu)型是特異性的。有些P450基因型對(duì)性別是特異的，及其僅對(duì)一種性別表達(dá)或?qū)δ骋环N性別的表達(dá)程度較高。例如，2C11、2C13、2A2和3A2是雄性特異型，而2C12為雌性特異型。

6 細(xì)胞色素P450與疾病

6.1 細(xì)胞色素P450與肝臟疾病

雖然細(xì)胞色素P450基因在許多組織中表達(dá)，但其在肝臟中活性極高，在肝臟的藥物毒物代謝中起重要的作用。已觀察到嚴(yán)重肝病(包括進(jìn)行性肝功衰竭和不可逆的肝硬化)患者的肝臟細(xì)胞色素P450水平及相應(yīng)的酶活性低于正常水平[12]。這些變化在很大程度上導(dǎo)致藥物消除和肝臟解毒功能障礙。其中細(xì)胞色素P450的作用大于細(xì)胞色素P450還原酶和其他有關(guān)酶，如葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移酶、硫化酶、N－乙酰轉(zhuǎn)移酶和氨基酸轉(zhuǎn)移酶[13]。在可逆性肝硬化、膽汁淤積、中度和輕度肝炎、脂肪肝等疾病中，肝臟細(xì)胞色素P450水平及相應(yīng)酶含量在正常范圍。嚴(yán)重肝病患者肝臟總體細(xì)胞色素P450水平降低原因尚不清楚，一般認(rèn)為，補(bǔ)償疾病，導(dǎo)致基因調(diào)控機(jī)制的障礙引起肝臟的酶量減少。細(xì)胞色素P450與肝臟疾病的關(guān)系尚不十分清楚，有人認(rèn)為CYP2E1與酒精性肝損傷有關(guān)，其可能機(jī)制是酒精誘導(dǎo)肝臟合成 CYP2EI，CYP2EI在富含花生四烯酸的環(huán)境下，產(chǎn)生活性氧中間體，誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，引起細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CYP2E1也能催化抗氧化劑維生素 C和 E合成，起抑制細(xì)胞損傷作用[14]。

6.2 細(xì)胞色素 P450與腫瘤

環(huán)境中的許多化學(xué)物質(zhì)是間接致癌物，它們進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝活化成為具有致癌作用的終產(chǎn)物，損傷生物大分子或與DNA結(jié)合，導(dǎo)致癌基因活化。致癌過(guò)程是多階段，在啟動(dòng)階段，外來(lái)物代謝酶基因的多態(tài)性在決定環(huán)境致癌物的效應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。不同個(gè)體對(duì)環(huán)境中各種致癌物前體的活化和解毒能力差異由遺傳差異決定，是個(gè)體對(duì)腫瘤的易感性差異基礎(chǔ)。

已經(jīng)確定的 CYP450同工酶多態(tài)性位點(diǎn)的有 1A1、2D6、2E1、2A6，攜CYP1A1MSPⅠ型人群易患腫瘤，且與年齡、吸煙量無(wú)關(guān)，而CYP2D6的研究結(jié)果卻是矛盾的;國(guó)內(nèi)學(xué)者調(diào)查結(jié)果顯示，中國(guó)人中有8% －10%為CYP1A1高誘導(dǎo)型，與吸煙所致的肺癌有顯著相關(guān)性。CYP17基因編碼與性激素合成有關(guān)的 CYPC17α酶，即類(lèi)固醇17－α羥化酶和17，20－羥化酶。Feigelson[15]等證實(shí)該基因型決定血清中激素水平，CYP17A2等位點(diǎn)突變使婦女在絕經(jīng)前血清中積聚較多雌二醇和黃體酮，致使絕經(jīng)后發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)性增加。

正常人胃組織中無(wú)CYP450，但胃癌患者中有51%和28%分別有CYP1A和CYP3A表達(dá)，盡管其機(jī)制尚末探險(xiǎn)明，但這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于胃癌的藥物治療有重大意義。

帕金森氏病可能與CYP450在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)催化一些反應(yīng)所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物引起神經(jīng)毒性有關(guān)[16]。Smith CAD等的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)臨床上對(duì)異喹胍等降壓藥代謝不敏感的人有早期帕金森氏病的傾向。Wacke R等最近研究也發(fā)現(xiàn)，慢性胰腺炎可以引起胰腺組織中 CYP1A1，CYP1A2，CYP2C9，CYP2E1和 CYP3A的變化，這些酶活性明顯加強(qiáng)，認(rèn)為胰腺組織內(nèi)CYP450的變化可能與慢性胰腺炎的發(fā)生有關(guān)，CYP450一些同工酶的變化與腫瘤、腎上腺增生性疾病、帕金森氏疾病等的發(fā)展有關(guān)，Ayesh等研究認(rèn)為肺癌的發(fā)展可能與CYP1A1活性變化有關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)CYP1A1基因的個(gè)體差異與肺癌的高危險(xiǎn)性有關(guān)[17]。Mckay JA等發(fā)現(xiàn)在乳腺癌病人CYP1B1同工酶活性增強(qiáng)，認(rèn)為其與乳腺內(nèi)的雌激素代謝有關(guān)。

近年來(lái)，一些學(xué)者通過(guò)對(duì)人體CYP基因多態(tài)性的研究，探討了CYP450與人類(lèi)疾病的關(guān)系。Tersuya K等最近的研究發(fā)現(xiàn)，CYP2A6基因的多態(tài)性變化可能與人體對(duì)某些腫瘤發(fā)病的易感性有關(guān)。鈣研究發(fā)現(xiàn)日本人群中，純合子整個(gè)CYP2A6基因的缺失率為3.9%;在肺癌病人中，鈣基因的缺失率明顯比健康人低，推測(cè)肺癌的發(fā)生可能與體內(nèi)CYP2D6活化某些致癌物質(zhì)有關(guān)，另一研究也證實(shí)了 CYP17、CYP1A1基因的多態(tài)性變化可能與乳腺癌的易感性有關(guān)。

7 結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞色素P450具有多種重要的生物學(xué)功能，同時(shí)可以預(yù)見(jiàn)通過(guò)調(diào)控其表達(dá)和活性來(lái)改變生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝途徑、產(chǎn)物的性質(zhì)和數(shù)量[18]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展、基因組學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和蛋白組學(xué)等學(xué)科的交叉與滲透，人們?yōu)檎{(diào)控、改變P450結(jié)構(gòu)和表達(dá)活性已成為可能并用于防止疾病和新藥開(kāi)發(fā)。此外，它也與生物的選擇進(jìn)化有關(guān)。

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