江宇，韓鐘霖，曹克將，汪道武

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

酒精性心肌病小鼠心電圖校正QT間期延長(zhǎng)的電生理機(jī)制探討*

江宇，韓鐘霖，曹克將，汪道武

目的：通過(guò)建立酒精性心肌病小鼠動(dòng)物模型，研究酒精性心肌病小鼠校正QT間期（QTc）延長(zhǎng)的電生理機(jī)制。

方法：將40只C57 BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組，酒精組（n=25）和對(duì)照組（n=15）。酒精組通過(guò)長(zhǎng)期飲酒和灌胃建立小鼠酒精性心肌病模型，因造模和麻醉過(guò)程中死亡12只小鼠，最終納入13只小鼠，對(duì)照組麻醉過(guò)程中死亡3只小鼠，最終納入12只。使用染色和電鏡驗(yàn)證酒精性心肌病模型，用小動(dòng)物心電圖測(cè)量小鼠心電圖相關(guān)指標(biāo)，通過(guò)酶解法將小鼠心室肌細(xì)胞進(jìn)行急性分離，最后使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)細(xì)胞動(dòng)作電位以及各種離子通道進(jìn)行電生理學(xué)檢測(cè)，并進(jìn)行通道相關(guān)動(dòng)力學(xué)急性檢測(cè)。

結(jié)果：5個(gè)月后，酒精組小鼠平均左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）值為（39.06±1.511）%，而對(duì)照組小鼠為（61.18±2.56）%。小鼠心電圖檢查顯示，酒精組平均QTc較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)[（106.43±5.91）ms vs （85.64±6.35）ms，P＜0.05]。全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒精組小鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極至90%所需時(shí)間（APD90）為（37.62±3.53）ms，對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞APD90為（25.77±3.41）ms。膜片鉗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酒精組小鼠L型鈣電流失活延遲，其窗口電流面積增大。

結(jié)論：長(zhǎng)期大量飲酒可導(dǎo)致心室肌鈣通道失活延遲，從而延長(zhǎng)心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位。這是酒精性心肌病小鼠心電圖QTc延長(zhǎng)的原因之一。

酒精性心肌?。恍Ｕ齉T間期；膜片鉗實(shí)驗(yàn)；動(dòng)作電位；L型鈣電流

Methods: A total of 40 C57BL/6 mice were randomly divided into 2 groups: Alcoholic group, n=25, the ACM model was established by long term alcohol drinking and intragastric alcohol administration, 12 mice died during modeling and anesthesia and 13 mice were enrolled for study. Control group, n=15, the mice were fed by normal diet, 3 died during anesthesia and 12 were enrolled for study. All animals were treated for 5 months. The pathological changes of ACM were examined by electric microscope, QT interval was measured by ECG, the electrophysiology of cell action potential duration and ion channels were detected by whole cell patch-clamp techniques.

Results: Alcohol group showed decreased left ventricle ejection fraction (LVEF) than Control group (39.06 ± 1.511) % vs (61.18 ± 2.56) %, prolonged QT interval (106.43 ± 5.91) ms vs (85.64 ± 6.35) ms, P＜0.05, and extended action potential duration APD90(37.62 ± 3.53) ms vs (25.77 ± 3.41) ms. Alcohol group also presented delayed voltage-dependent inactivation of L-type Ca2+channel and increased window current area.

Conclusion: Long term alcohol drinking may cause extended inactivation of myocardium Ca2+channel, prolong the action potential duration, which is one of the mechanisms for prolonged QT interval of ACM in experimental mice.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:374.)

眾所周知，校正QT間期（QTc）延長(zhǎng)和離散增加與心律失常密切相關(guān)，QTc延長(zhǎng)也是酒精性心臟病猝死患者中常見(jiàn)的現(xiàn)象之一[1-3]。這部分患者發(fā)生QTc延長(zhǎng)的概率為22%～46.9%[4]。QT間期與動(dòng)作電位時(shí)程（APD）的變化與心肌細(xì)胞離子通道功能相關(guān)，目前已有研究證明多種動(dòng)物心肌細(xì)胞在急性酒精作用下可影響細(xì)胞APD。Williams等[5]發(fā)現(xiàn)，5分鐘的酒精暴露即可下調(diào)家犬心臟蒲肯野纖維的APD。然而，相關(guān)研究多側(cè)重于酒精對(duì)心肌離子通道的急性變化，這種變化并不能完全代表臨床長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)及電生理重構(gòu)的變化。由于目前關(guān)于慢性飲酒對(duì)心肌電生理的影響的研究尚不充分，因此本研究旨在慢性酒精性心臟病小鼠的基礎(chǔ)上，觀察并探討小鼠QTc變化的機(jī)制，為今后的臨床研究提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

酒精性心肌病小鼠模型的建立：2013-03至2014-09使用6周齡立特艾比拉特洛波C57BL/6清潔級(jí)小鼠[由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0004]40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分組，酒精組25只，對(duì)照組15只，兩組小鼠平均體重?zé)o明顯差異。參考Wei Liu等[6]大鼠酒精性心肌病造模方法，酒精組依次給予濃度為5%、10%酒精自由飲一周后，在10%酒精自由飲的基礎(chǔ)上，以30%酒精灌胃0.2 ml/d，持續(xù)5個(gè)月造模（含酒精飲用水為唯一水源）。對(duì)照組以同等熱量的葡萄糖水灌胃。

超聲心動(dòng)圖結(jié)構(gòu)及功能測(cè)定：在造模和麻醉過(guò)程中，酒精組死亡12只小鼠，最終剩余13只；對(duì)照組死亡3只，最終僅剩12只。使用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（Vevo770，Visual Sonics，加拿大）進(jìn)行二維超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，超聲探頭為RMV70型。計(jì)量資料連續(xù)測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期取平均值。測(cè)量指標(biāo)包括室間隔厚度（IVS）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室后壁收縮厚度（LVPW）。

心電圖測(cè)量：造模5個(gè)月后隨機(jī)從酒精組和對(duì)照組各取7只小鼠進(jìn)行心電圖測(cè)量（酒精組小鼠麻醉過(guò)程中死亡1只，僅剩6只），接通多道生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)（RM6240B，成都儀器廠，中國(guó)），用0.1 ml 10%的水合氯醛麻醉小鼠，3～5 min待小鼠安靜后，取小鼠仰位，電極連線分為紅色（E）右上肢、黑色（EB）右下肢、綠色（HB）左下肢（Ⅱ?qū)В?，將針電極分別刺入其四肢皮下，記錄Ⅱ?qū)?lián)的心電圖。

心肌病理形態(tài)學(xué)、電鏡和心肌膠原纖維染色：造模5個(gè)月后用斷頸術(shù)處死3只小鼠，取出心臟，用4%甲醛固定，石蠟包埋，取左心室冠狀面制備3 mm薄切片，蘇木精-伊紅（HE）染色和馬松（masson）染色后顯微鏡下觀察形態(tài)變化。另取1 mm×1 mm左右的組織，固定、脫水、包埋、切片、染色進(jìn)行透射電鏡（JEOL-1010，日本電子，日本）觀察。

單個(gè)心室肌細(xì)胞的分離：酒精組和對(duì)照組各選用造模5個(gè)月的4只小鼠以1000 U/kg肝素皮下注射，斷頸后，快速取出心臟，置于Langendorff灌流系統(tǒng)中，在37℃恒溫下進(jìn)行主動(dòng)脈逆行灌流，流速3 ml/min。用臺(tái)氏液[正常臺(tái)氏液成分（單位mmol/L）：氯化鈉140；氯化鉀5.4；氯化鈣1.8；氯化鎂0.5；4-羥乙基哌嗪乙磺酸5.0；葡萄糖5.5；磷酸二氫鈉0.4，酸堿度（pH）用氫氧化鈉調(diào)至7.40]灌流1 min排除殘留血液后，換無(wú)鈣臺(tái)氏液[為正常臺(tái)氏液中不加鈣離子]灌流5 min排出液體中鈣離子，最后用含有0.05%膠原酶Ⅱ（Type 2，Worthington，美國(guó)）液體灌流12～15 min。取下心臟，將心室肌剪碎、吹打成單個(gè)心室肌細(xì)胞，自然沉淀，吸取上清液，用上述不含膠原酶的液體在室溫下孵育10 min、在KB液（單位mmol/L：氫氧化鉀70，氯化鉀40，磷酸二氫鉀20，L-谷氨酸50，?；撬?0，乙二醇雙四乙酸0.5，4-羥乙基哌嗪乙磺酸10，葡萄糖10，用氫氧化鉀將pH調(diào)節(jié)至7.3）中孵育2 h后，選擇其中紋理清晰、表面光滑的單個(gè)心室肌細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

小鼠心室肌細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)：全細(xì)胞記錄單個(gè)心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位和鈉電流、L型鈣電流以及瞬

時(shí)外向鉀通道電流。將細(xì)胞懸液滴于三維倒置顯微鏡（IX50，OLYMPUS，日本）工作臺(tái)上的灌流槽內(nèi)，待細(xì)胞黏附于槽底后，用細(xì)胞外液灌流，灌流速度l ml/min。玻璃微電極（1.4 mm，南京泉水電生理儀器廠，中國(guó)）用玻璃微電極拉制儀（P-1000 Model，Sutter Instrument，美國(guó)）拉制，電極灌沖內(nèi)液后的電阻是1～3 MΩ，電極與膜片鉗放大器（Axopatch 200B，Axon Instrument，美國(guó)） 相連，當(dāng)電極尖端與細(xì)胞表面接觸后，以持續(xù)負(fù)壓吸引，使電極尖端與細(xì)胞表面形成高阻抗（1 G以上）封接，再以微小負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，計(jì)算機(jī)補(bǔ)償快速膜電容，形成全細(xì)胞記錄。在全細(xì)胞電流鉗狀態(tài)下記錄到心室肌細(xì)胞的靜息電位，然后給予脈寬3 ms、電流強(qiáng)度200～400 pA的刺激，即可誘發(fā)小鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生。測(cè)量心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極至90%所需時(shí)間（APD90）；在全細(xì)胞電壓鉗狀態(tài)下，用細(xì)胞外液灌流5 min，分別記錄鈉電流、L型鈣電流以及瞬時(shí)外向鉀電流及相關(guān)動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。

2 結(jié)果

心電圖結(jié)果：通過(guò)對(duì)小鼠Ⅱ?qū)?lián)的觀察，發(fā)現(xiàn)酒精組（n=6）小鼠的心率、PR間期、RR間期和QRS間期與對(duì)照組（n=7）沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），QTc延長(zhǎng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表1

心功能觀察結(jié)果：5個(gè)月后，酒精組小鼠（n=13）LVEF和LVFS值均低于對(duì)照組（n=12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。表2

表1 兩組小鼠的心電圖比較分析（

表1 兩組小鼠的心電圖比較分析（

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05

?

表2 兩組小鼠心功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

表2 兩組小鼠心功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05。LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù) LVPWd：左心室后壁厚度 IVS：室間隔厚度LVFS：左心室短軸縮短率

?

心肌組織電鏡、病理和心肌膠原染色結(jié)果：通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)酒精組小鼠心肌細(xì)胞老化、縮小，肌纖維斷裂不規(guī)則（圖1B，箭頭標(biāo)注），而對(duì)照組心肌細(xì)胞飽滿，肌纖維排列整齊（圖1A），兩組masson染色無(wú)明顯差異（圖1D、1C）。在電鏡下，酒精組出現(xiàn)明顯可以看到部分肌絲斷裂，肌絲間可見(jiàn)潤(rùn)盤縫隙連接區(qū)斷裂，致密斑消失，脂滴生成（圖1F，箭頭標(biāo)注）；而對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)有輕度凝集現(xiàn)象，肌細(xì)胞各帶結(jié)構(gòu)明顯，細(xì)胞器豐富（圖1E）。圖1

圖1 兩組小鼠心肌組織目鏡病理和電鏡結(jié)果

膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果：酒精組小鼠心肌細(xì)胞（n=9）APD90較對(duì)照組（n=13）明顯延長(zhǎng)[（37.62±3.53）ms vs（25.77±3.41）ms]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。圖2

離子通道電流及其動(dòng)力學(xué)測(cè)量發(fā)現(xiàn)，酒精組小鼠的鈣通道電流密度絕對(duì)值較對(duì)照組有所減少[（-7.49±0.56）pA/pF

vs （-10.31±0.60）pA/pF，P＜0.05）]（圖3），但酒精組失活動(dòng)力學(xué)檢測(cè)下半失活電壓向負(fù)極方向移動(dòng)，提示較對(duì)照組明顯失活延遲[（-31.78±1.44）mV vs （-39.55 ± 1.26）mV，P＜0.05]，而激活動(dòng)力學(xué)檢測(cè)下兩組無(wú)明顯差異。表3

圖2 兩組小鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極至90%所需時(shí)間比較（

圖3 兩組小鼠心肌細(xì)胞L型鈣電流電流電壓曲線的比較

表3 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈣電流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

表3 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈣電流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05； V1/2：半失活電位 K：斜率

?

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鈉電流與動(dòng)作電位的誘發(fā)及心電傳導(dǎo)有關(guān)。酒精組小鼠心肌細(xì)胞（n=17）和對(duì)照組（n=13）的鈉電流密度分別為[（36.00±2.41）pA/ pF vs（36.66±1.63）pA/pF] ，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖4），激活和失活動(dòng)力學(xué)中斜率K酒精組均小于對(duì)照組，有微小差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

圖4 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈉電流電流電壓曲線的比較

表4 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈉電流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

表4 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈉電流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05。余注見(jiàn)表3

?

瞬時(shí)外向鉀電流是小鼠心室肌細(xì)胞復(fù)極的主要外向電流。酒精組小鼠心室肌細(xì)胞（n=9）鉀電流密度與對(duì)照組（n=9）無(wú)明顯差異[（44.45±6.45）pA/ pF vs（48.93±8.74）pA/pF，P＞0.05]，且兩組小鼠心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀通道動(dòng)力學(xué)也無(wú)明顯差異（P＞0.05）。圖5、表5

圖5 兩組小鼠心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流電流電壓曲線的比較

表5 兩組小鼠心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀通道動(dòng)力學(xué)比較

表5 兩組小鼠心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀通道動(dòng)力學(xué)比較

注：V1/2和K注釋見(jiàn)表3

?

3 討論

飲酒是常見(jiàn)的猝死原因[7]，長(zhǎng)期大量飲酒可使心臟擴(kuò)大，心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂，心肌收縮功能減退，左心室射血分?jǐn)?shù)降低[8]，且可增加心源性猝死風(fēng)險(xiǎn)[9]。本研究中酒精組小鼠通過(guò)5個(gè)月的酒精飼養(yǎng)和灌胃，出現(xiàn)LVEF和LVFS降低等心功能下降等情況；病理檢查發(fā)現(xiàn)酒精組小鼠心肌細(xì)胞肌纖維斷裂不規(guī)則，電鏡下肌絲斷裂，潤(rùn)盤縫隙連接區(qū)斷裂，致密斑消失，脂滴生成；同時(shí)酒精組小鼠心電圖QTc顯著延長(zhǎng)；這些特征與相關(guān)報(bào)道相符[6,10,11]。在全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)中，酒精組小鼠APD90延長(zhǎng)，鈣通道失活延遲，鈣通道窗口電流增大。雖然酒精組小鼠的鈣電流密度減小，但是其失活動(dòng)力學(xué)顯著延遲，鈣通道窗口電流增大，提示鈣通道功能部分上調(diào)。此外，鈣通道功能的上調(diào)是8型長(zhǎng)QT間期綜合征患者QTc延長(zhǎng)的原因之一，Boczek等[12]的研究發(fā)現(xiàn)突變的鈣通道雖然電流減小，但是開(kāi)放提前，功能上調(diào)，最終的結(jié)果是窗口電流增大，這就表明鈣通道在激活和失活的交替過(guò)程中，有更多的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致復(fù)極時(shí)所需鉀離子增多。本研究發(fā)現(xiàn)鈣通道電壓依賴性失活延遲而電壓依賴性激活變化不明顯，綜合起來(lái)可導(dǎo)致窗口電流增大，這與之前的研究結(jié)果有類似之處，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)外向鉀電流密度無(wú)明顯差異；綜合來(lái)看，以上因素可能是動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)的主要原因之一。而且鈣通道窗口電流增大還可引起早期后除極，這也是導(dǎo)致心律失常發(fā)生的重要機(jī)制之一[13]。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，在急性酒精浸潤(rùn)情況下，細(xì)胞動(dòng)作電位縮短，鈉電流、鉀電流、鈣電流都有一定程度減小，但這反映的是酒精的急性作用，并不能說(shuō)明在長(zhǎng)期酒精作用下患者心臟電生理是否發(fā)生改變。本研究的結(jié)果提示鈉電流可能并不是導(dǎo)致酒精性心肌病心電活動(dòng)異常的主要原因。我們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期飲酒使鈣通道的失活延遲，開(kāi)放時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，導(dǎo)致鈣通道窗口電流增大，從而使動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，最終促使小鼠QTc延長(zhǎng)，而QTc延長(zhǎng)是引起心室復(fù)極異常的重要原因，后者為猝死的心電基質(zhì)[15]。這為酒精性心肌病患者猝死發(fā)生率升高提供了新的電生理學(xué)理論依據(jù)。

[1] Day CP, James OF, Butler TJ, et al. QT prolongation and sudden cardiac death in patients with alcoholic liver disease. Lancet, 1993, 341: 1423-1428.

[2] Day CP, McComb JM, Campbell RW. QT dispersion: an indication of arrhythmia risk in patients with long QT intervals. Br Heart J, 1990, 63: 342-344.

[3] Kupari M, Koskinen P. Alcohol, cardiac arrhythmias and sudden death. Novartis Found Symp, 1998, 216: 68-85.

[4] Yokoyama A, Ishii H, Takagi T, et al. Prolonged QT interval in alcoholic autonomic nervous dysfunction. Alcohol Clin Exp Res, 1992, 16: 1090-1092.

[5] Williams JW, Tada M, Katz AM, et al. Effect of ethanol and acetaldehyde on the （Na++K+）-activated adenosine triphosphatase activity of cardiac plasma membranes. Biochem Pharmacol, 1975, 24: 27-32.

[6] Liu W, Li J, Tian W, et al. Chronic alcohol consumption induces cardiac remodeling in mice from Th1 or Th2 background. Exp Mol Pathol, 2011, 91: 761-767.

[7] 李明, 黃京璐, 王小廣, 等. 622例猝死案例的流行病學(xué)調(diào)查. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2014, 29: z1.

[8] Kim SD, Bieniarz T, Esser KA, et al. Cardiac structure and function after short-term ethanol consumption in rats. Alcohol, 2003, 29: 21-29.

[9] Bertoia ML, Triche EW, Michaud DS, et al. Long-term alcohol and caffeine intake and risk of sudden cardiac death in women. Am J Clin Nutr, 2013, 97: 1356-1363.

[10] Lorsheyd A, de Lange DW, Hijmering ML, et al. PR and QTc interval prolongation on the electrocardiogram after binge drinking in healthy individuals. Neth J Med, 2005, 63: 59-63.

[11] Corovic N, Durakovic Z, Misigoj-Durakovic M. Dispersion of the corrected QT and JT interval in the electrocardiogram of alcoholic patients. Alcohol Clin Exp Res, 2006, 30: 150-154.

[12] Boczek NJ, Miller EM, Ye D, et al. Novel Timothy Syndrome Mutation Leading to Increase in CACNA1C Window Current. Heart Rhythm, 2015, 12: 211-219.

[13] Ming Z, Nordin C, Aronson RS. Role of L-type calcium channel window current in generating current-induced early after depolarizations. J Cardiovasc Electrophysiol, 1994, 5: 323-334.

[14] Bebarova M, Matejovic P, Pasek M, et al. Effect of ethanol on action potential and ionic membrane currents in rat ventricular myocytes. Acta Physiol, 2010, 200: 301-314.

[15] 郭繼鴻. 中國(guó)心臟性猝死現(xiàn)狀與防治. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2013, 28: 323-326.

The Electrophysiological Mechanism of QT Prolongation in Experimental Mice With Alcoholic Cardiomyopathy

JIANG Yu, HAN Zhong-lin, CAO Ke-jiang, WANG Dao-wu.
Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing (210029), Jiangsu, China

Objective: To investigate the electrophysiological mechanism of QT prolongation in experimental mice with alcoholic cardiomyopathy (ACM).

Alcoholic cardiomyopathy; QT interval; Patch clamp; Action potential duration, L-type calcium current

2014-12-19）

（編輯：朱柳媛）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81170159）；江蘇省六大人才高峰資助項(xiàng)目（2012-WS-018）

210029 江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科

江宇 碩士研究生 主要從事心臟起搏與電生理相關(guān)研究 Email: 328450715@qq.com 通訊作者：汪道武 Email: david37212@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2015）04-0374-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.04.018