詹小芬張芹周露楊輝楊惠鈿楊立業(yè)林敏★

·論著·

云南省西雙版納州傣族G6PD缺陷癥發(fā)生率及突變譜研究

詹小芬1張芹2周露3楊輝1楊惠鈿1楊立業(yè)1林敏1★

目的了解云南省西雙版納州傣族人群的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥的發(fā)生率及基因型。方法在2012年8月至2013年9月期間，用熒光斑點定性法對812例傣族居民進行G6PD缺乏篩查。用反向斑點雜交芯片和PCR-DNA測序法分析G6PD缺乏癥的標本的基因型。結果云南西雙版納州傣族人群的G6PD缺乏癥總發(fā)生率為9.73％（79／812），其中男性32例（9.07％，32／353），女性47例（10.24％，47／459）。79例初篩G6PD缺乏標本65例檢測出有突變，共檢出8種基因突變類型，含16例1376G＞T（24.24％）、10例1311C＞T（15.15％）、9例1388G＞A（13.63％）、7例392G＞T（10.60％）、6例95A＞G（9.09％）、5例1360C＞T（7.57％）、2例871G＞A（3.03％）、1例1024C＞T（1.52％），和6種復合突變包括2例G871A／C1311T（3.03％）、2例G392T／G1376T（3.03％）、2例G392T／G1388A（3.03％）、1例C1024T／C1311T（1.52％）、1例C1311T／G1376T（1.52％）、1例C1311T／G1388（1.52％）。結論云南西雙版納州傣族G6PD缺乏癥檢出率高，最常見的三種基因型是G6PD1376G＞T、1311C＞T和G6PD1388G＞A。在西雙版納地區(qū)當?shù)亻_展G6PD缺乏癥的新生兒篩查、產前篩查和遺傳咨詢是非常有必要的。

G6PD缺乏癥；傣族；基因突變；斑點雜交；PCR-DNA測序

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenas，G6PD）缺乏癥，又稱蠶豆病，是由G6PD基因發(fā)生突變而引起的一種X染色體連鎖不完全顯性遺傳性溶血性酶缺陷疾?。?］。大部份人終身沒有任何臨床癥狀，只有在某些誘因下（抗瘧藥物、蠶豆等），可導致急性溶血性貧血、核黃疸等一系列病理改變。此病雖呈全球性分布，但各人種和地區(qū)存在差異，總體呈“南高北低”趨勢［2］。云南省是我國少數(shù)民族最多的省份，G6PD缺乏癥也是云南少數(shù)民族地區(qū)高發(fā)的遺傳性疾病。傣族，也稱“泰老民族”或“傣泰民族”，源于中國的云貴高原，是世居云南的少數(shù)民族之一。

本文對西雙版納州景洪市的傣族人群進行了G6PD缺乏癥的分子流行病學調查，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2013年8月至2013年9月，在西雙版納州景洪市農墾醫(yī)院采集了體檢的傣族812名人的血樣標本，包括353名男性，459名女性。本研究得到云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會、南方醫(yī)科大學附屬潮州市中心醫(yī)院倫理委員會批準。在獲得患者的知情同意之后，用Whatman S＆S903濾紙制備干血斑，自然干燥后密封保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 G6PD熒光斑點定性試驗

用G6PD活性篩查試劑盒（純化學反應熒光法）（廣州米基醫(yī)療器械有限公司，廣州）進行G6PD活性篩查，按試劑盒說明書進行操作。結果判斷標準如下——活性正常者：10 m in內出現(xiàn)強熒光；中度缺乏者：10 m in～30 m in出現(xiàn)熒光為中度缺乏值；重度缺乏或完全缺乏：30 m in不出現(xiàn)熒光［3］。

1.3 基因分型

1.3.1 基因組DNA提取

用Chelex法提取G6PD酶學異常標本的DNA［3］：首先剪切0.5 cm×0.5 cm濾紙血斑，加500μL去離子蒸餾水，震蕩30 s，然后靜置半小時以上；接著震蕩后用13 600 rpm離心4 m in，棄上清，加160μL的10％濃度的Chelex-100懸液，振蕩后用56℃孵育2 h，接著98℃變性8 min，振蕩30 s，13 500 rpm離心1 m in；最后放置于4℃冰箱冷卻30 m in，吸取上清備用。

1.3.2 基因分型流程

采用廣東凱普生物公司生產的G6PD缺乏癥基因檢測試劑盒（PCR＋反向斑點雜交）檢測13個中國人常見G6PD基因突變位點，分別為：A95G、G392T、A493G、C592T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、G871A、C1004T、C1024T、C1387T、G1388A。PCR、斑點雜交及結果判讀嚴格按照說明書執(zhí)行。對用反向斑點雜交未檢測出G6PD基因突變的標本進行2至13號外顯子進行測序，方法均按照本實驗室以往文獻［2］。

2 結果

在812例傣族中，共檢出G6PD酶學缺乏的樣本79例，總檢出率為9.73％。其中，男女檢出率分別為9.07％（32／353）和10.24％（47／459）。男性檢出率略低于女性檢測率，但兩者之間不存在統(tǒng)計學差異（χ2＝0.313，P＝0.576）。

79例G6PD酶學缺陷樣本經(jīng)反向斑點雜交芯片分析，在65例（男29例，女36例）樣本中發(fā)現(xiàn)G6PD存在突變，占82.3％。部分膜反向斑點雜交結果見圖1。樣本共檢出8種G6PD基因點突變，包括95A＞G（c.185A＞G）、392G＞T（c.482G＞T）、871G＞A（c.961G＞A）、1024C＞T（c.1114C＞T）、1311C＞T（c.1401C＞T）、1360C＞T（c.1450C＞T）、1376G＞T（c.1466G＞T）、1388G＞A（c.1478G＞A）。檢出6種復合突變包括G871A／C1311T、G392T／G1376T、G392T／G1388A、C1024T／C1311T、C1311T／G1376T、C1311T／G1388A，結果詳見表1。傣族人群最常見的基因型為1376G＞T（24.61％，16／65）和1311C＞T（15.38％，10／65），其次是1388G＞A（13.84％，9／66），3種點突變占所有病例總數(shù)的50％以上，男性半合子未發(fā)現(xiàn)有C1024T基因型。此外，還有14例（女11例，男3例）經(jīng)膜反向斑點雜交未檢測出突變的樣本，進行2～13外顯子和外顯子-內含子接合區(qū)進行基因測序檢測，與人G6PD基因序列（GeneBank：NC＿000023.10）進行比對，未發(fā)現(xiàn)其他突變。

3 討論

表1 傣族人群G6PD缺乏癥患者基因型結果Table 1 Genotyping results of G6PD deficiency among Dai population

圖1 G6PD基因突變部分膜反向斑點雜交結果Figure 1 Results of reverse dot blot analysis for G6PD mutations

G6PD缺乏癥是最常見的一種遺傳性酶缺乏病，全世界約4億人受累。我國是本病的高發(fā)區(qū)之

一，主要分布在長江以南各省，以云南，廣東，廣西，海南，貴州等省為高，其發(fā)病原因是由于G6PD基因突變，導致酶活性降低，紅細胞不能抵抗氧化損傷而遭受破壞，引起溶血性貧血。本次篩查結果發(fā)現(xiàn)西雙版納州地區(qū)傣族人群的G6PD缺乏癥總發(fā)生率為9.73％，低于1987年云南省計劃生育研究所在德宏州調查的傣族為16.1％的結果［4］，高于忽麗莎等研究的西雙版納州傣族2.6％的結果［5］，這可能與不同民族，地區(qū)或者不同的研究方法有關。目前，用于G6PD缺乏癥篩查的方法很多，G6PD熒光斑點試驗是國際血液學標準委會（ICSH）推薦用于G6PD缺乏癥的方法，具有較好的敏感性和特異性。本次篩查男性G6PD缺乏癥檢出率為9.07％，女性G6PD缺乏癥檢出率為10.24％。雖然女性發(fā)生率略高于男性，但兩者之間無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.313，P＝0.576）。這可能是由于篩查的人數(shù)少、抽樣偏差所造成的。女性純合子和雜合子的估算可從男性檢出率讀出，但G6PD缺乏率只代表有表現(xiàn)型的發(fā)生率，女性雜合子不易全部檢出，因此發(fā)生率會比估計值偏低。G6PD基因型的確定有助于G6PD缺乏癥的明確診斷，尤其是酶活性差異很大的女性雜合子。

PCR＋膜雜交法的檢測原理是采用生物素標記的引物分別對G6PD基因突變區(qū)域進行特異性擴增，將擴增產物與固定在尼龍膜上的不同突變位點探針在導流雜交儀上進行導流雜交（flowthrough hybridization），然后通過化學顯色對結果進行判讀。具有準確性高，特異性好，低DNA濃度也能準確檢出等優(yōu)點。試劑盒能實現(xiàn)對多個突變位點的同步檢測。本次篩查的79例G6PD缺乏樣本中有65例存在突變，共發(fā)現(xiàn)了8種基因點突變，以1376G＞T、1311C＞T、1388G＞A這3種突變?yōu)橹?，其次?92G＞T、95 A＞G、1360C＞T、871G＞A、1024C＞T。我們還發(fā)現(xiàn)了6種復合突變包括G871A／C1311T、G392T／G1376T、G392T／G1388A、C1024T／C1311T、C1311T／G1376T、C1311T／G1388A。本次研究結果以1376G＞T最常見。與以往調查的云南傣族以G1388A為最常見突變類型不同［6］，也與我國南方的壯、瑤、傣、苗、黎、畬族等少數(shù)民族G6PD缺乏癥以G1376T和G1388A為主不同［7］。本次研究結果雖然1376G＞T（24.61％）大于1388 G＞A（13.84％），但還是以1376G＞T和1388G＞A突變類型為主，符合中國人群最常見的2種G6PD基因突變類型。這種可能是由于以往多采用AMRS-PCR或PCR-RFLP法對突變進行鑒定［8］，能夠鑒定的突變類型較少，而此次我們斑點雜交芯片能鑒定的類型較多，因此造成比例的不同。我們還發(fā)現(xiàn)了大量的C1311T（15.38％）突變，除了G871A／C1311T、C1024T／C1311T、C1311T／G1376T、C1311T／G1388A四種復合突變外，10例C1311T突變的酶學結果也降低。由于C1311T是同義突變，不引起功能的改變，在臨床上是屬于良性的，因此，我們推測C1311T同時合并（除了13種常見位點外）的其它有功能的外顯子的突變，而引起酶活性降低［8］。

西雙版納傣族自治州屬于G6PD缺乏癥高發(fā)區(qū)，開展G6PD缺乏癥的篩查，指導臨床醫(yī)生用藥、G6PD缺乏癥基因型的診斷、防止攜帶者通婚、能夠提高人口素質和促進優(yōu)生優(yōu)育工作的進行。

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The prevalence and mutation s distribution of G6PD deficiency among Daipopulation in Xishuangbanna region,Yunnan province

ZHAN Xiaofen1,ZHANG Qin2,ZHOU Lu3,YANG Hui1,YANG Huitian1,YANG Liye1,LIN M in1★
(1.The Central Laboratory,Affiliated Chaozhou Central Hospital,Southern Medical University,Chaozhou, Guangdong,China,521000；2.The Medical Laboratory,First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunm ing，Yunnan,China,650000；3.The Medical Laboratory,Xishuangbanna Agricultural Reclamation Hospital,Jinghong,Xishuangbanna,Yunnan,China,666100)

Objective To investigate the prevalence and mutation distribution of Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)deficiency among Dai population in Xishuangbanna region,Yunnan province.Methods From Aug 2012 to Sep 2013,812 Dai subjects were screened for G6PD deficiency by fluorescent spot test(FST).Then,all the screening positive samples were identified by reverse dot blot (RDB)chip and PCR-DNA sequencing.Results The prevalence of G6PD deficiency was 9.73％(79/812) among Dai population,of which 9.07％(32/353)in males and 10.24％(47/459)in females.Totally,65 of

Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)deficiency；Dai population；mutation；Reverse dot blot(RDB)；PCR-DNA sequencing

國家自然科學基金（81101329）；中國博士后科研基金（2013M 542195）；廣東省醫(yī)學科研基金（A2013780）

1.南方醫(yī)科大學附屬潮州市中心醫(yī)院中心實驗室，廣東，潮州521000 2.云南省第一人民醫(yī)院檢驗科，云南，昆明650000 3.西雙版納農墾醫(yī)院檢驗科，云南，西雙版納傣族自治州，景洪666100

★通訊作者：林敏，E-mail：konfutea＠hotmail.com

the 79 screening positive samples were detected w ith coding mutations in G6PD gene that encompassing 8 kind of mutation types included 16 cases of 1376 G＞T(24.24％),10 cases of 1311C＞T(15.15％),9 cases of 1388 G＞A(13.63％),7 cases of 392 G＞T(10.60％),6 cases of 95 A＞G(9.09％),5 cases of 1360 C＞T(7.57％),2 cases of 871 G＞A(3.03％)and 1 cases of 1024 C＞T(1.52％).At the same time,6 kind of compound mutation are observed in our study cohort including 2 cases of G871A/C1311T(3.03％), 2 cases of G392T/G1376T(3.03％),2 cases of G392T/G1388A(3.03％),1 cases of C1024T/C1311T (1.52％),1 cases of C1311T/G1376T(1.52％)and 1 cases of C1311T/G1388(1.52％).Conclusion The prevalence of G6PD deficiency was high among Dai population.G6PD 1376 G＞T、1311C＞T and G6PD1388 G＞A were the 3 most common mutations in this region.Obligatory newborn screening program, prenatal screening and counseling for G6PD deficiency were importantand necessary in Xishuangbannan region.