涂紅艷，肖 望 ，謝 君，魏燕霞

(廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東高校應(yīng)用生態(tài)工程技術(shù)開發(fā)中心，廣州510303)

所羅門姜黃(Curcuma soloensis Valeton)是姜科(Zingiberaceae)姜黃屬(Curcuma)多年生根狀莖草本花卉植物，其穗狀花序從根狀莖抽出，呈圓寶塔狀，花色高雅脫俗，花期長達半年. 所羅門姜黃是切花的優(yōu)雅花材，瓶插壽命可達15 ～20 d，極具觀賞價值和經(jīng)濟價值［1－2］.

所羅門姜黃通常采用傳統(tǒng)的分切根狀莖繁殖，受季節(jié)限制，且繁殖系數(shù)低，每年只可獲得2 ～3 倍的增殖率，加之栽培過程易受病害影響，很難滿足其市場開發(fā)的需求，故難以在花卉市場占據(jù)一席之地［1］.組織培養(yǎng)技術(shù)是大量快速繁殖所羅門姜黃的有效途徑.目前所羅門姜黃離體植株再生體系的建立主要是通過以芽繁芽方式直接再生植株［3］和通過愈傷組織間接再生植株［2］2 種途徑. 利用薄層細胞培養(yǎng)技術(shù)建立所羅門姜黃的離體植株再生體系目前尚未見報道.

薄層細胞培養(yǎng)(thin cell layer，TCL)，最初是指從外植體表皮部位撕下一塊厚3 ～6 層細胞(包括表皮、亞表皮及皮層細胞)的薄片置于適宜培養(yǎng)基上進行的固體或液體培養(yǎng)，現(xiàn)在也將外植體橫切成大約0.3 ～1.0 mm 厚的薄片(micro-cross section)進行培養(yǎng)，統(tǒng)稱為薄層細胞培養(yǎng)［4－5］. 薄層細胞培養(yǎng)是研究植物形態(tài)發(fā)生的一個較理想的實驗體系. 由于薄層細胞培養(yǎng)的外植體體積小、細胞數(shù)目少、內(nèi)源生長物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)含量較少，所以對外界因子的調(diào)節(jié)較為敏感.它在激素組成與用量方面比常規(guī)用器官為外植體進行的組織培養(yǎng)少，但芽再生率較高，再生周期短［5－8］.薄層細胞培養(yǎng)還可應(yīng)用到植物基因工程和作物改良中，由于薄層的橫切面?zhèn)谳^大，可作為優(yōu)良的轉(zhuǎn)化受體，增加轉(zhuǎn)化幾率，且薄層僅僅由幾層細胞組成，易于篩選，減少了嵌合體的出現(xiàn)頻率［9－10］.利用此技術(shù)已在油菜(Brassica napus)、煙草(Nicotiana plumbaginifolia)、馬唐(Digitaria sanguinalis)、菊花(Dendranthema ×grandiflora)［11］等植物中成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株. 本研究以所羅門姜黃試管苗莖基部為外植體，將它們的橫切薄層放在添加不同外源激素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽的再生，同時還研究了培養(yǎng)基組成對不定芽成苗生長的影響，旨在建立高效、穩(wěn)定的所羅門姜黃薄層再生體系，為通過生物技術(shù)進行植物品種改良提供良好的植株再生體系.

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料所羅門姜黃(Curcuma soloensis Valeton)于2012年3月采集于廣州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心種植基地，選取1 ～3 cm 長的根狀莖腋芽作為外植體.

1.2 方法

1.2.1 不定芽的誘導(dǎo)與試管苗的獲得 選擇生長狀況良好的根狀莖腋芽，用水沖洗干凈后用洗潔精浸泡30 min，再用流水沖洗30 min，用75%乙醇溶液進行表面消毒30 s，再經(jīng)1 g/L HgCl2溶液消毒15 ～20 min，無菌水沖洗5 ～6 次. 切取長0.5 ～2.0 cm 的芽作為外植體，將外植體接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基［12］Ms+3 mg/L 6－BA +0.2 mg/L NAA 中，誘導(dǎo)出不定芽.將誘導(dǎo)出的1 ～2 cm 不定芽轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基1/2 Ms+1 g/L 活性炭中進行培養(yǎng)，得到健壯的試管苗.

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo) 取健壯試管苗(圖1A)，從上到下依次切取厚約0.5 ～0.8 mm 的薄層，將莖基部第1 條生根部位標(biāo)示為1，向上、向下分別標(biāo)號為2、3、4;－1、－2、－3、－4(圖1B)等.將切取的薄層放入含有不同濃度的激素的培養(yǎng)基中(表1)，在光照或黑暗條件下誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，研究試管苗莖基部不同部位薄層的出芽數(shù)，以及6－BA、TDZ 和光照條件對薄層出芽的影響，30 d 后統(tǒng)計出芽數(shù).

圖1 所羅門姜黃試管苗莖基部薄層切取位置示意圖Figure 1 Thin cell layers cut from stem base of regenerated plantlets of Curcuma soloensisValeton

1.2.3 成苗培養(yǎng) 將從薄層誘導(dǎo)出的不定芽分別接種于1/2 Ms、1/2 Ms +1 g/L 活性炭2 種成苗培養(yǎng)基中，研究培養(yǎng)基的組成對不定芽成苗的影響，30 d 后統(tǒng)計植株的根數(shù)、根長、葉片數(shù)和葉片間距等指標(biāo).

1.2.4 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度控制在25 ±2 ℃，光照強度30 μmol/(m2·s)，光照時間16 h 光/8 h 暗.

1.2.5 煉苗移栽和馴化 從培養(yǎng)瓶中取出試管苗，用自來水沖洗干凈根部殘留的培養(yǎng)基，栽植于自封袋(15 cm×20 cm)內(nèi)富含有機質(zhì)的土壤(于花卉市場購買的營養(yǎng)土、培養(yǎng)土等)中，土壤用量為30 ～50 mL，每袋種植植株1 ～2 棵，用濃度為1/20 Ms 培養(yǎng)基的無機鹽溶液一次澆透，整個過程不再需要施肥.在自封袋內(nèi)培植30 ～60 d 后，移栽到花盆里，置于蔭棚內(nèi)培養(yǎng)，得到所羅門姜黃的花卉苗.

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有實驗結(jié)果重復(fù)3 次，所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示. 采用鄧肯多重分析法進行顯著性差異分析，最小顯著性差異在5%水平上顯示.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同切片部位對薄層切片出芽的影響

以所羅門姜黃試管苗(圖1A)莖基部第1 條生根部位為基礎(chǔ)切取含有生長點細胞的薄層(圖1B)，向上向下可再切取3 ～4 片薄層，平均每個外植體可切6 ～8 片薄層.苗越壯，切取的薄層數(shù)越多，最多一棵苗可切到10 片.培養(yǎng)1 周后，大部分薄層都可以出芽，其中在第1 條生根部位切取的薄層(圖1B 中的標(biāo)號1)出芽能力最強，達到2.75個，緊接其下的薄層部位(圖1B 中的標(biāo)號－1)和其上的薄層部位(圖1B 中的標(biāo)號2)出芽能力次之，分別為1.95 和1.75個(圖2).

薄層培養(yǎng)3 ～4 d 開始出現(xiàn)芽點，7 d 長出2 ～3 cm 的小芽，14 d 芽開始抽出葉，21 d 芽長出少量根，30 d 時統(tǒng)計，每片薄層一般可出1 ～3個芽(圖3 B)，最高可出8個芽(圖3C). 隨著培養(yǎng)時間的延長，不斷長出新芽.培養(yǎng)45 d 后從一棵試管苗所切薄層中最高可獲得15個不定芽，增殖倍數(shù)高達15倍.薄層出芽率受苗的健壯度的影響較大，以健壯的苗切的薄層出芽多.

圖2 所羅門姜黃薄層不同部位的出芽數(shù)Figure 2 Frequency of adventitous shoot formation at different positions from thin cell layer culture of Curcuma soloensis Valeton

2.2 不同激素組合和光照條件對所羅門姜黃薄層出芽的影響

與只添加生長素NAA 相比，在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素6－BA 或TDZ 能顯著促進薄層不定芽的產(chǎn)生. 隨著6－BA 或TDZ 質(zhì)量濃度增大，薄層出芽數(shù)增加. 薄層在光照培養(yǎng)30 d，6－BA 質(zhì)量濃度為3 mg/L 或TDZ 質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 時，出芽數(shù)最高，分別達到9.3 或10個(表1). 在黑暗培養(yǎng)15 d，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)15 d 后，薄層的出芽數(shù)明顯增加，最高可獲得12.2個芽，比在光照培養(yǎng)30 d 的薄層出芽數(shù)增加了31.2%. 當(dāng)培養(yǎng)基只有生長素類物質(zhì)時，薄層出芽數(shù)較低. 薄層出芽的最適培養(yǎng)基為MS+3 mg/L 6－BA +0.2 mg/L NAA，培養(yǎng)條件為15 d 黑暗培養(yǎng)加上15 d 光照培養(yǎng).

表1 激素組合和培養(yǎng)條件對所羅門姜黃薄層外植體出芽數(shù)的影響Table 1 Effects of hormone combinations and culture condition on number of adventitous shoots formation from thin cell layer culture of Curcuma soloensis Valeton

2.3 不同培養(yǎng)基對不定芽成苗生長的影響

從薄層誘導(dǎo)出的不定芽分別接種到不同的成苗培養(yǎng)基中.發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基中的再生植株在根長、葉片數(shù)和葉間距上表現(xiàn)出顯著的差異(表2). 培養(yǎng)基中添加1 g/L 活性炭后，根的數(shù)量變化不大，但總根長增加，次級須根增多，葉片數(shù)增加，葉間距明顯縮短，葉片顏色深綠，株型緊湊，苗生長健壯，與活性炭減弱光照保護IAA，間接促進根生長，從而促進莖、葉生長有關(guān)［13－14］.

表2 不同培養(yǎng)基對所羅門姜黃不定芽成苗的影響Table 2 Effects of medium components on shoot regeneration of Curcuma soloensis Valeton

2.4 試管苗的室外馴化生長

取成苗培養(yǎng)基中獲得的試管苗(圖3A)，從其莖基部繼續(xù)切取含有生長點細胞的薄層進行不定芽的再生培養(yǎng).經(jīng)過15 代的繼代培養(yǎng)(圖3E)，薄片不定芽增殖倍數(shù)保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)再生頻率下降的現(xiàn)象，即在1個繼代周期內(nèi)，1 棵試管苗最多可獲得15個不定芽，增殖倍數(shù)高達15 倍. 而吳國江等［1］采用以芽繁芽的方式進行所羅門姜黃的快繁，在1個繼代周期中，1個芽可形成5 ～10個再生芽，增殖倍數(shù)為5 ～10 倍.

將試管苗移栽到自封袋后都能成活(圖3F).在自封袋培植30 ～60 d 后，移栽到花盆，生長狀況良好，成活率高達95%以上(圖3G).試管苗移栽到花盆后，最快的生長3.5個月即現(xiàn)花蕾，開花正常，每棵植株當(dāng)年至少可抽1 ～2 枝花序，部分多達3 枝(圖3H).從不同成苗培養(yǎng)基中獲得的試管苗室外開花期較相近，為47 d 左右. 花期可持續(xù)5個月以上，花朵開放可持續(xù)到當(dāng)年的12月中旬. 當(dāng)氣溫下降到7 ～19 ℃時，植株會很快枯萎.試管苗室外種植2年多來，未發(fā)現(xiàn)變異苗.

薄層細胞培養(yǎng)用于通過生物技術(shù)進行植物品種改良的研究.本研究團隊采用薄層細胞培養(yǎng)技術(shù)對白姜花(Hedychium coronarium)的薄層進行體外誘變處理，成功獲得了白姜花四倍體植株［15］，經(jīng)過近3年的栽培，植株的各種性狀保持穩(wěn)定遺傳，為所羅門姜黃進行品種改良奠定了良好的基礎(chǔ).

圖3 利用薄層細胞培養(yǎng)技術(shù)建立所羅門姜黃植株再生體系Figure 3 Plant regeneration system from thin cell layer culture in Curcuma soloensis Valeton

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