楊玉萍，李宜蕓，李茜雯，王小菁

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣州510631)

紫錐菊屬(Echinacea Moenc)是原產(chǎn)于北美洲的一種野生菊科花卉，該屬有8個種及數(shù)個變種，已開發(fā)為藥品者主要為紫錐菊E. purpurea(也稱紫松果菊)、紫錐菊E. angustifoLia(松果菊)和白松果菊E. paLLia，均是多年生草本［1－2］.

紫錐菊(Echinacea purpurea)的主要特征是花托為圓錐形，具有管狀花和舌狀花，通常為玫瑰色或紫色，是美麗的觀賞花卉，且具有較高的藥用價值. 紫錐菊含有菊苣酸、羥基酰胺、多糖、倍半萜、多炔類、咖啡酸衍生物、黃酮等多種活性成分，用以治療感染、關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核、氣管炎、扁桃體炎、濕疹等［3－5］.菊苣酸是其重要的生理活性成分，具有抑制透明質(zhì)酸酶的復(fù)制和抗HIV-1 的功效，還防止膠原質(zhì)受自由基誘導(dǎo)而降解［4－5］. 紫錐菊的藥理作用顯著，在國際上受到普遍重視，作為一種免疫促進(jìn)和調(diào)節(jié)劑，市場需求量大［6］. 而廣州地區(qū)栽種的紫錐菊產(chǎn)量及其藥用成分菊苣酸含量均高于原產(chǎn)地，適宜推廣種植［7］.

20世紀(jì)末，我國成功引種紫錐菊［3］，主要采用傳統(tǒng)種子育苗方式繁殖，但由于種子的采集困難，前期低溫處理時間長［8］，萌發(fā)率低［3］，育苗有較大難度，難以實現(xiàn)規(guī)?；? 陳榮等［7］在廣州地區(qū)引種紫錐菊的過程中，通過技術(shù)改良將種子萌發(fā)率提高到60%以上，直播時每穴播3 顆種子保證出苗整齊，但是采集種子困難、價格高仍是采用直播法大規(guī)模種植紫錐菊的限制因素. 以無菌幼苗的不同營養(yǎng)器官為外植體建立了高效的再生體系的報道［9－13］.以葉片和莖已成功誘導(dǎo)出不定芽［14－15］，但尚無報道以根、葉柄為外植體直接誘導(dǎo)出不定芽，建立更簡單高效的紫錐菊再生體系對于開展其遺傳轉(zhuǎn)化工作十分必要.

本文以廣州引種的紫錐菊不同營養(yǎng)器官(根、葉柄、葉片)為外植體，建立高效的再生體系，其中，以葉柄為外植體的不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)94.8%.研究結(jié)果可為紫錐菊的快繁和遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)體系，也為從基因水平研究藥用成分的合成途徑并為品種的遺傳改良奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料

紫錐菊(E. purpurea)種子由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳鴻教授饋贈.

1.2 培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)方法

1.2.1 播種 挑選飽滿的種子并剝?nèi)ネ鈿ぃ扔皿w積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒30 ～45 s，體積分?jǐn)?shù)為5%NaClO 消毒5 ～6 min，再用無菌水沖洗5 ～8 次. 消毒后用25 mg/L GA3溶液浸泡2 h 后接種于無菌水潤濕的濾紙上，10 d 后將萌發(fā)的種子移至MS 培養(yǎng)基(pH 5.8)中. 培養(yǎng)室溫度22±2 ℃，16 h 光/8 h 黑暗.

1.2.2 不定芽誘導(dǎo) 紫錐菊長至4 ～6 cm 時，將葉片切成0.5 cm×0.5 cm 小塊，將根和葉柄切成長度約0.5 cm 小段，分別置于不同質(zhì)量濃度NAA(0、0.5、1.0 mg/L)和6－BA(0、1.0、2.0 mg/L)配比的9 種MS 培養(yǎng)基中(表1)，篩選不定芽誘導(dǎo)最佳激素配比. 其中MS 為基本培養(yǎng)基，附加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%蔗糖和0.8%瓊脂，pH 5.8 ～6.2，配制分裝后，于121 ℃滅菌20 min 后待用(下同). 每個培養(yǎng)皿(直徑10 cm)接種20 ～30(葉片)或50 ～60(根、葉柄)個外植體，材料置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計誘導(dǎo)率. 誘導(dǎo)率=(分化出不定芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100%. 平均出芽數(shù)=出芽總數(shù)/分化出不定芽的外植體數(shù).

1.2.3 繼代培養(yǎng) 將不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS +0.5 mg/L 6－BA)中葉柄上長出的新芽(高1 cm 左右)切下，轉(zhuǎn)接到不同質(zhì)量濃度NAA(0、0.2、0.5 mg/L)和6－BA(0.3、0.5、1.0 mg/L)配比的MS 培養(yǎng)基中(表2)，篩選繼代培養(yǎng)最佳激素配比. 每瓶接種3株. 培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計增殖系數(shù). 增殖系數(shù)=新生的植株數(shù)量/原來植株數(shù)量.

1.2.4 生根培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)基(MS +0.5 mg/L 6－BA)中獲得的無根苗(3 cm 左右)切下，轉(zhuǎn)到MS培養(yǎng)基和MS+0.5 mg/L NAA 培養(yǎng)基中，每瓶接種2 株. 培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計生根率和根的數(shù)量，選擇最適生根培養(yǎng)基. 生根率=生根苗數(shù)量/生根培養(yǎng)基中苗的總數(shù))×100%.

1.2.5 煉苗與移栽 待苗長至5 ～7 cm 且具有發(fā)達(dá)的根時，逐漸擰松培養(yǎng)瓶的蓋子進(jìn)行煉苗，煉苗5 ～7 d后將苗取出，洗去附著在苗上的培養(yǎng)基，移栽到泥炭土及腐質(zhì)土混合的基質(zhì)中，用塑料蓋罩住以保持濕度，5 d 后取出塑料蓋. 每個處理移栽30 株，統(tǒng)計成活率. 成活率=(移栽成活的苗數(shù)量/移栽苗的總數(shù))×100%. 成活后，可按常規(guī)進(jìn)行栽培管理.

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽誘導(dǎo)

將葉柄、根分別切成0.5 cm 小段，葉片切成長度約0.5 cm×0.5 cm 小塊，分別置于誘芽培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3 d 后，切口處均膨大，1 周后，切口處開始出現(xiàn)愈傷組織. 結(jié)果(表1)表明，在9 種不同激素配比的培養(yǎng)基中，葉片外植體在培養(yǎng)基2.0 mg/L 6－BA 中，誘導(dǎo)率最高(73.7%)，平均出芽數(shù)為1.2(圖1B);而在培養(yǎng)基0.5 mg/L 6－BA +0.2 mg/L NAA中，平均出芽數(shù)最高(為1.8)，誘導(dǎo)率卻僅有19.0%，在培養(yǎng)基2.0 mg/L 6－BA+0.2 mg/L NAA 中，誘導(dǎo)率為11.1%. 綜合考慮誘導(dǎo)率和平均出芽數(shù)，葉片外植體的不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基是MS +2.0 mg/L 6－BA+3% 蔗糖+0.8% 瓊脂.

在9 種不同激素配比的培養(yǎng)基中，根外植體在培養(yǎng)基0.5 mg/L 6－BA+0.2 mg/L NAA 中，誘導(dǎo)率最高(43.8%)，平均出芽數(shù)為1.9(圖1C);而在培養(yǎng)基1.0 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA 中，平均出芽數(shù)最高，達(dá)到2.6. 綜合考慮誘導(dǎo)率和平均出芽數(shù)，根外植體的不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L 6－BA+0.2 mg/L NAA+3% 蔗糖+0.8% 瓊脂.

在9 種不同激素配比的培養(yǎng)基中，葉柄外植體在培養(yǎng)基0.5 mg/L 6－ BA 中不定芽誘導(dǎo)率最高(94.8%)，平均出芽數(shù)為2.0(圖1A)，最多可達(dá)6.0;而在培養(yǎng)基2.0 mg/L 6－BA +0.2 mg/L NAA中，誘導(dǎo)率最低(6.2%)，但可形成較多的不定芽.通過比較各處理可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度一定時，隨著6－BA 質(zhì)量濃度的增加，誘導(dǎo)率呈下降趨勢.綜合考慮誘導(dǎo)率和平均出芽數(shù)，葉柄外植體的不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基是MS +0.5 mg/L 6－BA +3%蔗糖+0.8% 瓊脂.

與葉片及根相比，以葉柄作為外植體誘導(dǎo)不定芽，可得到最高的誘導(dǎo)率及平均出芽數(shù)，為不定芽誘導(dǎo)適宜外植體.

2.2 繼代培養(yǎng)

根據(jù)不定芽誘導(dǎo)實驗結(jié)果(表1)，以葉柄為外植體，于培養(yǎng)基MS +0.5 mg/L 6－BA 中培養(yǎng)30 d可得到最多不定芽. 因此，將不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6－BA)中葉柄上長出的新芽(高1 cm 左右)切下，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計新增芽的數(shù)目. 結(jié)果表明(表2)，僅含有6－BA(0.5 mg/L)的培養(yǎng)基上增殖系數(shù)大且新苗健壯，容易進(jìn)行繼代培養(yǎng)(圖1D).

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑對不同外植體不定芽分化的影響Table 1 Effects of different plant growth regulator combinations on the bud differentiation from three kinds of explants

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對葉柄再生苗增殖系數(shù)的影響Table 2 Effects of different plant growth regulator combinations on the bud proliferation coefficient

2.3 生根培養(yǎng)與煉苗

將增殖培養(yǎng)基(MS +0.5 mg/L 6－BA)中獲得的無根苗(3 cm 左右)切下，轉(zhuǎn)到MS 基本培養(yǎng)基和MS+0.5 mg/L NAA 培養(yǎng)基上生根培養(yǎng). 在MS 培養(yǎng)基中，幼苗1 周后開始生根，30 d 時根的數(shù)目為5±2，長度可達(dá)10 cm，主根粗，顏色為黃綠色(圖1E)，少數(shù)部分呈現(xiàn)紫紅色;在MS +0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中，幼苗一周后開始生根，30 d 時根的數(shù)目為6 ±2，長度可達(dá)8 cm，沒有主根，顏色呈現(xiàn)紫紅色，少數(shù)為淺黃色. 以MS 基本培養(yǎng)基和MS +0.5 mg/L NAA 培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基的移栽存活率分別為93.3%、53.3%. 比較移栽存活率，MS 培養(yǎng)基更適宜紫錐菊幼苗后來的生根移栽. 移栽到泥炭土及腐質(zhì)土混合的基質(zhì)中，7 d 后長出新葉，28 d 后植株快速生長，再生苗生長健壯、葉片濃綠，3個月左右即可開花(圖1F).

3 討論

本研究以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，探究NAA、6－BA 配比對紫錐菊不同外植體不定芽誘導(dǎo)和再生苗增殖的影響，結(jié)果表明葉柄、葉片及根均可快速誘導(dǎo)出正常不定芽，其中，外植體以生長20 ～30 d 的葉柄誘導(dǎo)效果最佳，不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)94.8%，再生苗增殖系數(shù)為9.0，最適培養(yǎng)基均為MS +0.5 mg/L 6－BA. 據(jù)報道［9－15］，紫錐菊葉、根、莖均可作為外植體，不同器官作為外植體所需植物生長調(diào)節(jié)劑配比不同. 李標(biāo)等［14］首次以紫錐菊葉片為外植體脫分化誘導(dǎo)愈傷組織，再分化形成再生植株，為紫錐菊的無性快繁提供了新途徑.王伯初等［15］以紫錐菊莖和葉片為外植體，用IBA、NAA、GA 等多種植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽分化，愈傷及不定芽誘導(dǎo)率均為90%左右.但是愈傷組織上分化出的芽容易發(fā)生變異，不容易保持母株的優(yōu)良特性. Choffe等［13］以生長2個月的葉柄為外植體，利用BAP、TDZ、NAA 等植物生長調(diào)節(jié)劑建立再生體系，在NAA 單獨存在時，誘導(dǎo)率僅為54.5%，同時添加多種植物生長調(diào)節(jié)劑(BAP、TDZ、NAA)才能使誘導(dǎo)率提高到80% ～90%. 本研究結(jié)果顯示，葉柄作為外植體，在6－BA 條件下，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到94.8%，因此，與已有的研究相比，本研究建立的葉柄再生體系具有外植體(葉柄)材料多、誘導(dǎo)率高、周期短等優(yōu)點，另外，所用植物生長調(diào)節(jié)劑僅為6－BA，配方簡單，經(jīng)濟(jì)實惠，可為大規(guī)模繁殖中的種苗快繁提供新的技術(shù)體系，降低種植成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，也為紫錐菊的轉(zhuǎn)基因提供簡單快捷的技術(shù)體系. 在本研究中，采用萌發(fā)20 ～30 d 的幼苗葉柄作為外植體.作者推測，這種幼嫩葉柄中含有更高的激素含量，為提高不定芽的誘導(dǎo)率奠定基礎(chǔ).

圖1 紫錐菊再生體系Figure 1 Plant regeneration of E. Purpurea

［1］肖培根.國際流行的免疫調(diào)節(jié)劑紫錐菊及其制劑［J］.中草藥，1996，27(1):46－48.

［2］張瑩，劉珂，吳立軍.紫錐菊屬藥用植物研究進(jìn)展［J］.中草藥，2001，32(9):852－855.Zhang Y，Liu K，Wu L J.Advances in studies on Echinacea Moench［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs，2001，32(9):852－855.

［3］馬小軍，王雅玲，解雪梅，等. 紫錐菊在北京地區(qū)的引種［J］.中國中藥雜志，1999，24(10):590－592.

［4］Soieke H，Hassan G A，Gorler K.Weitere kafeesaure derivate aus Eehinacea purpurea ［J］. Planta Medica，1988，54:175.

［5］Robinson W E J. L－ chicoric acid，dicaffeoyltaric acid inhibitor of HIV integrase，improves on the in vitro anti－HIV effete of zi－ Dovudine and a protease inhibitor(AG1350)［J］. Antiviral Research，1998，39:101－111.

［6］Sun L Z，Currier N L，Miller S C. The American coneflower:A prop Hylactic role involving nonspecific immunity［J］. Journal of Alternative Complementary Medicine，1999，5(5):437－446.

［7］陳榮，楊躍生，吳鴻. 廣州地區(qū)紫錐菊引種與露地栽培試驗初報［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(10):20－22.Chen R，Yang Y S，Wu H. Introduction and outdoor growing techniques of Echinacea purpurea in Guangzhou［J］.Guangdong Agricultural Sciences，2011(10):20－22.

［8］郝團(tuán)軍. 紫錐菊育苗及栽培技術(shù)［J］. 新疆中草藥，2007(9):61.

［9］Koroch A，Juliani H R，Kapteyn J，et al. In vitro regeneration of Echinacea purpurea from leaf explants［J］.Plant Cell Tissue Organ Culture，2001，69:79－83.

［10］Lakshmanan P，Danesh M，Taji A. Production of four commercially cultivated Echinacea species by different methods of in vitro regeneration［J］. Journal Horticultural Science Biotechnology，2002，77:158－163.

［11］Mechanda S M，Baum B R. Direct shoot regeneration from leaf segments of mature plants of Echinacea purpurea(L)Moench［J］.In vitro Cellular and Develpmental Biology Plant，2003，39(5):505－509.

［12］Sauve R J，Mmbaga M T，Zhou S P. In vitro regeneration of the Tennessee coneflower (Echinacea Tennesse)［J］.In vitro Cellular and Develpmental Biology Plant，2004，40(3):325－328.

［13］Choffe K L，Vict or J M R，Murch S J，et al. In vitro regeneration of Echinacea L.:Direct somatic embryogenesis and indirect shoot organogensis in petiole culture［J］. In vitro Cellular and Develpmental Biology Plant，2000，36:30－36.

［14］李標(biāo)，唐坤，劉毅，等. 藥用紫錐菊葉片離體培養(yǎng)技術(shù)研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(3):344－345.Li B，Tang K，Liu Y，et al. A study on leaves vitro culture technology of medicine Echiancea purpurea［J］. Li Shi Zhen Medicine and Materia Medica Research，2006，17(3):344－345.

［15］王伯初，劉萬錢，段傳人.紫錐菊的組織培養(yǎng)及其實用快速繁殖［J］.重慶大學(xué)學(xué)報，2005，28(5):120－122.Wang B C，Liu W Q，Duan C R. Tissue culture and rapid propagation of echinacea purpurea［J］. Journal of Chongqing University，2005，28(5):120－122.