曹大紅

（江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校生物制藥教研組，江蘇徐州　221116）

病毒類疫苗生產(chǎn)過程中的動物細胞培養(yǎng)及其技術(shù)發(fā)展

曹大紅

（江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校生物制藥教研組，江蘇徐州221116）

疫苗是人類有效預(yù)防各種傳染病的手段，病毒類疫苗在生產(chǎn)過程中需要對相應(yīng)病毒進行培養(yǎng)，由于病毒是專營宿主細胞內(nèi)寄生型微生物，所以就要有對相關(guān)動物細胞的培養(yǎng)技術(shù)涉及其中。本文通過研讀《中華人民共和國藥典》第三部中預(yù)防類生物制品的制造內(nèi)容，和疫苗生產(chǎn)中細胞培養(yǎng)相關(guān)參考文獻，對病毒類疫苗生產(chǎn)中的哺乳動物細胞及相關(guān)基本培養(yǎng)過程、技術(shù)發(fā)展進行了闡述。

病毒類疫苗生物制品細胞培養(yǎng)

疫苗是將病原微生物（如細菌、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。根據(jù)其所預(yù)防的傳染病病原體種類不同大致可分為細菌類疫苗和病毒類疫苗兩大類?，F(xiàn)在在人群中使用的病毒類疫苗，除了乙肝疫苗是通過基因工程方法制得，其他病毒類疫苗生產(chǎn)都需要通過對病毒的培養(yǎng)，而后再經(jīng)過純化、濃縮、或滅活或裂解等過程制備。病毒體是一類專營宿主細胞內(nèi)寄生型微生物，其繁殖需要在其特定的宿主細胞內(nèi)進行。所以，病毒類疫苗生產(chǎn)過程中對病毒的培養(yǎng)就需要首先培養(yǎng)病毒體能夠在其中繁殖的動物細胞。直接感染動物培養(yǎng)病毒存在著不同個體之間的差異，后繼純化程序太過繁瑣等缺點，存在一定的安全隱患，所以此種病毒培養(yǎng)方法現(xiàn)在已經(jīng)基本被淘汰。

在2010年版的《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《藥典》）第三部生物制品類中預(yù)防類生物制品共包括48種疫苗，其中病毒類疫苗共有27種，分別針對乙型腦炎、森林腦炎、狂犬病、流感、乙型肝炎、甲型肝炎、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹和腎綜合征出血熱等11種病毒性傳染病。在這27種病毒類疫苗的生產(chǎn)工藝過程中，有兩種重組乙型肝炎疫苗是使用重組CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞）和重組酵母菌生產(chǎn)乙型肝炎表面抗原蛋白質(zhì)作為疫苗抗原，其他病毒類疫苗生產(chǎn)中病毒的培養(yǎng)方式全是在動物細胞中，包括，通過原代細胞培養(yǎng)方式、通過人二倍體細胞或Vero細胞培養(yǎng)方式、在雞胚中培養(yǎng)方式。在相應(yīng)的病毒接種之前，首先要做的工作就是培養(yǎng)這些動物細胞。

1　動物細胞培養(yǎng)一般過程

動物細胞培養(yǎng)是指在體外培養(yǎng)活的動物細胞群體，當(dāng)前，許多生物技術(shù)領(lǐng)域都會使用到此項技術(shù)。特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值。比如疫苗或基因工程藥物在研究生產(chǎn)過程中很多是通過細胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的。動物細胞培養(yǎng)常用的儀器設(shè)備包括，無菌室、超凈工作臺、低溫冰箱、pH計、壓力蒸氣消毒器、電熱恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)器具、CO2培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、倒置顯微鏡、離心機、無菌過濾器、洗刷裝置、細胞計數(shù)板和電子細胞技術(shù)儀等等［1］。細胞培養(yǎng)又可分為原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)。

1.1原代細胞培養(yǎng)

原代細胞培養(yǎng)是將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖的過程。其基本步驟包括：取材、剪切、消化、分離、計數(shù)、培養(yǎng)，在所有的操作過程中，都必須保持培養(yǎng)物及其生長環(huán)境的無菌［2］。由于原代培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)化極性較小，對病毒敏感性好，因此適應(yīng)制備疫苗。在《藥典》第三部病毒類疫苗中，包括利用原代兔腎細胞培養(yǎng)風(fēng)疹病毒，利用原代猴腎細胞培養(yǎng)脊髓灰質(zhì)炎病毒，利用原代地鼠腎細胞培養(yǎng)狂犬病病毒、乙型腦炎病毒、腎綜合征出血熱病毒、森林腦炎病毒，利用原代雞胚細胞培養(yǎng)麻疹病毒、腮腺炎病毒，利用原代沙鼠腎細胞培養(yǎng)腎綜合征出血熱病毒。

但原代細胞培養(yǎng)也存在著有潛在外源因子、不能事先檢查標(biāo)化、且受供體年齡健康狀況的影響而導(dǎo)致批間差異大等缺陷。因此，利用穩(wěn)定的傳代細胞來代替原代細胞培養(yǎng)這些病毒成為未來發(fā)展方向?！端幍洹返谌恐?，上述的各類病毒的不同毒株也有在人二倍體細胞中培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗，如：風(fēng)疹病毒BRDⅡ減毒株、脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin株，還有在Vero細胞中生產(chǎn)的凍干人用狂犬病疫苗、凍干乙型腦炎滅活疫苗等。

1.2傳代細胞培養(yǎng)

傳代細胞培養(yǎng)，當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代或者再培養(yǎng)，對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。疫苗生產(chǎn)中的傳代細胞培養(yǎng)是指對穩(wěn)定細胞系的培養(yǎng)，取出生產(chǎn)指定用的冷凍保存細胞系，經(jīng)過細胞復(fù)蘇后進行培養(yǎng)過程。《藥典》第三部中規(guī)定疫苗生產(chǎn)可利用的傳代細胞是人二倍體細胞和Vero細胞。

人二倍體細胞株來源于正常人胎兒組織，主要用于培養(yǎng)病毒制備疫苗。用于疫苗生產(chǎn)的細胞株，必須符合相關(guān)規(guī)程要求。不能含有外源因子，核型正常，對病毒敏感和具有足夠多的細胞種子。第一株人二倍體細胞（HDC）WI－38建立于1961年，此后發(fā)現(xiàn)狂犬病毒PV株、PM株、HEP株、LEP株都可以在HDC中持續(xù)感染。法國于1974年12月批準了人二倍體細胞狂犬病疫苗（HDCV），因為它的高度安全性，HDCV也被WHO（世界衛(wèi)生組織）推薦為金標(biāo)準參考疫苗。但是，其生產(chǎn)成本很高，所以通常僅適應(yīng)于發(fā)達國家［3］。

Vero細胞是由日本學(xué)者Yasumura等于1962年從正常成年非洲綠猴腎分離獲得的貼壁依賴性細胞系，它也是WHO和我國認可的疫苗生產(chǎn)細胞系。與用作疫苗生產(chǎn)的原代細胞、二倍體細胞和其他一些傳代細胞基質(zhì)相比，Vero細胞具有以下特點：①來源方便，可連續(xù)傳代，生長速度快；②對多種病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；⑧遺傳性狀穩(wěn)定，惡性轉(zhuǎn)化程度低，生物安全性較高；④培養(yǎng)條件要求不苛刻，易于在生物反應(yīng)器實施大規(guī)模培養(yǎng)。因此Vero細胞也成為眾多病毒類疫苗生產(chǎn)科研人員研究對象。有已經(jīng)應(yīng)用成功的狂犬病疫苗，處于臨床試驗期的流感疫苗，還有正處于研發(fā)過程中的脊髓灰質(zhì)炎疫苗、乙型腦炎疫苗等［4、5］。

2　流感病毒的培養(yǎng)

流感疫苗生產(chǎn)過程中流感病毒的培養(yǎng)是在雞胚尿囊腔中接種，病毒感染雞胚尿囊腔上皮細胞培養(yǎng)方式。這種方式也是目前流感疫苗生產(chǎn)最常見的方式。但是，在實際應(yīng)用中存在不同批次雞胚供用之間有差異，在流感爆發(fā)季節(jié)雞胚供用量無法滿足，和生產(chǎn)過程人力勞動量大等不足之處。所以，使用動物細胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)流感疫苗就進入了人們視野。WHO也建議使用已經(jīng)建立的哺乳動物細胞系替代雞胚進行流感疫苗生產(chǎn)［6］。目前實驗使用的細胞有Vero細胞、Madin Darby狗腎細胞（MDCK）等。

3　病毒細胞培養(yǎng)的不足與其技術(shù)發(fā)展

由于疫苗使用對象是健康人群和嬰幼兒，它的安全性始終是人們所關(guān)注的焦點。使用原代細胞培養(yǎng)和使用含有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞來生產(chǎn)病毒疫苗存在著不同批次原代細胞或血清之間有差異、易帶入外源蛋白因子等一定的安全隱患。因此，現(xiàn)在科學(xué)研究一方面致力于尋找適用于細胞系培養(yǎng)的病毒株，另一方面在研究使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞技術(shù)。Vero細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在狂犬病疫苗生產(chǎn)中成功運用，在流感疫苗生產(chǎn)中運用目前已經(jīng)處于臨床試驗期間［4］。另外在細胞大規(guī)模生產(chǎn)中使用的生物反應(yīng)器技術(shù)的發(fā)展也是病毒類疫苗生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵技術(shù)。國外推廣較多的生物反應(yīng)器有：美國NBS公司的填充床細胞培養(yǎng)反應(yīng)器和Wave搖袋式一次性細胞培養(yǎng)反應(yīng)器［7］。微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為動物細胞大規(guī)模生產(chǎn)中較常采用的技術(shù)。通過體外表達病毒結(jié)構(gòu)蛋白，在特定狀態(tài)下可自動裝配成在形態(tài)上類似于天然病毒的空心顆粒的病毒樣顆粒（VLPs），利用此項技術(shù)生產(chǎn)疫苗也已經(jīng)成為病毒類疫苗生產(chǎn)的一種新途徑。

［1］ Rajeev Nema， Sarita Khare. An animal cell culture： Advance technology for modern research ［J］.Advances in Bioscience and Biotechnology， 2012，3，219-226.

［2］周珍輝主編.動物細胞培養(yǎng)技術(shù)［M］.中國環(huán)境出版社，2006（08）：01［3］王月，黃思佳.現(xiàn)代狂犬病疫苗生產(chǎn)用細胞和毒種：現(xiàn)狀與前景［J］.國際生物制品學(xué)，2012.vol35.No.5.

［4］陳天，陳克平，陳昭烈.Vero細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)的研究與應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通訊，2009.vol20.No.3，417－425.

［5］王輝，過琴媛，張月蘭等.Vero細胞乙型腦炎純化疫苗生產(chǎn)工藝參數(shù)的研究［J］.生物學(xué)免疫學(xué)進展，2006年第34卷第3期.

［6］Perdue M L，Arnold F，Li S，et a1.The future of cell culture based influenza vaccine productions［J］.EXPERT REV VACCINES. 201l.10（8）：1183—1194.

［7］李一鋒.流感病毒及其疫苗傳代細胞制備研究進展［J］.生物學(xué)，2012年4月，第29卷第2期.

曹大紅，1974年12月，男，江蘇徐州人，江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校，生物制藥專業(yè)教師，講師，生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)碩士研究生，研究方向：生物制藥技術(shù)。