聶松柳，沈炳香，段自皞，蔣俊杰，王法財

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院藥學(xué)部，安徽六安 237005)

大劑量甲氨蝶呤(HD-MTX)是臨床治療急性淋巴細胞白血病(ALL)和骨肉瘤患者的重要化療方案。然而，MTX體內(nèi)代謝過程、血藥濃度個體差異大，在抑制腫瘤細胞發(fā)揮療效的同時也增加了對機體正常細胞的毒性，可產(chǎn)生嚴重甚至致命的毒副作用，如腎衰、肝損害、骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、皮膚黏膜反應(yīng)以及因此而引起的繼發(fā)感染、出血等［1］。

MTX血藥濃度監(jiān)測能滿足化療方案的個體化，增加療效，有效減少MTX的毒副作用，已為臨床所公認。

本研究使用Spearman相關(guān)分析法分析了MTX 20 h和44 h血藥濃度與MTX實驗室肝腎功能指標之間的聯(lián)系，探討了監(jiān)測MTX 20 h、MTX 44 h的血藥濃度在預(yù)防甲氨蝶呤毒性中的作用。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 美國Waters公司高效液相色譜儀，梅特勒-托利多AL104、ABS135-S電子天平，梅特勒-托利多pH酸度計，飛鴿牌GL-16G-2超低溫高速離心機，飛鴿牌TDL80-2B普通離心機，減壓干燥箱，水浴鍋，微型漩渦混合儀。

1.2 試藥 對照品:MTX(批號:100138-200603)由中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇為色譜純(美國TEDIA公司)，水為自制雙蒸水，其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 對象 2009年11月—2014年6月入住我院成人ALL患者，接受大劑量甲氨蝶呤(HD-MTX)化療+亞葉酸鈣(CF)解救方案進行治療。記錄患者化療前后血常規(guī)、肝腎功能、血糖、血脂、乳酸脫氫酶(LDH)等相關(guān)實驗室檢驗指標。

2.2 用藥方案及樣本采集 MTX劑量為3～6 g·m-2，起始0.5 g在30 min內(nèi)快速靜脈滴注，剩余量在剩下的23.5 h內(nèi)靜脈維持輸注。用藥當(dāng)天給予5%碳酸氫鈉靜滴，使尿液pH＞7;在化療當(dāng)天及后3 d內(nèi)給予大量水化;MTX應(yīng)用結(jié)束后24 h應(yīng)用CF分次解救，每6 h一次，共8次，首劑加倍，解救至MTX血藥濃度＜0.1μmol·L-1。血液樣本分別于MTX靜滴結(jié)束后0、20、44 h采集，取靜脈血2 mL。

2.3 血液樣本處理 血液樣本3 000 r·min-1離心，分離血清。取血清200μL，加15%高氯酸30 μL，漩渦混合 1 min，15 000 r·min-1離心 10 min，吸取上清液180μL置一干凈離心管中，加入4 mol·L-1NaOH 10 μL，漩渦混合30 s，取25 μL進樣。

2.4 色譜條件 色譜柱:Waters symmetry柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，C18)，保護柱:Waters保護柱(20 mm ×3.9 mm，5 μm，C18);流動相:磷酸鹽緩沖液(pH6.8)∶甲醇 =80∶20(V/V);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:35℃;紫外檢測波長:306 nm。杭州英譜HS色譜數(shù)據(jù)工作站 V4.0+。血清中雜質(zhì)對MTX檢測無干擾，MTX基線分離，MTX保留時間為13.1 min，色譜分析在20 min內(nèi)完成。

2.5 血清標準曲線及線性關(guān)系 MTX:精密稱取MTX對照品適量，用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解配制為200μmol·L-1原液，以MTX原液和空白血清配制濃度為 0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol·L-1標準血清樣品。采用“2.2”項下方法處理進樣，檢測結(jié)果根據(jù)峰高(Y)和濃度(X)進行線性回歸。因MTX濃度跨度大，為減少誤差，分兩段處理。結(jié)果，分別得回歸方程:Y1=1 520.6X-34.199(r=0.999 4，n=6)和 Y2=1 517.5X-948.98(r=0.999 5，n=6)。表明本方法的甲氨蝶呤檢測濃度分別在 0.05 ～2.5 μmol·L-1、2.5 ～100μmol·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度測定結(jié)果 取標準液一定量同上述操作，配成 1、10、100 μmol·L-13 種濃度，每種濃度平行做3份，按前述方法提取進樣，連續(xù)測定3 d，計算日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果日內(nèi)、日間RSD分別為(4.0 ±1.31)%、(4.9 ±1.13)%，說明測定方法能滿足血藥濃度分析的要求。

2.7 提取回收率試驗 取1、10、100μmol·L-13種濃度的標準液，按“2.3”項下方法操作，測定得MTX峰高H1，同時配制與各濃度質(zhì)控樣品相同標示量的水溶液直接進樣，測定MTX峰高H2，計算各濃度樣品提取回收率(提取回收率 =H1/H2×100%)，結(jié)果見表1。

表1 絕對回收率及方法回收率(n=6)

2.8 穩(wěn)定性試驗 取1μmol·L-1的MTX標準血樣1 mL，置-20℃凍存，連續(xù)凍融3次，分別于凍存前及每次凍融后測定MTX濃度，考察凍融穩(wěn)定性。結(jié)果，3次反復(fù)凍融后測定的濃度為凍融前測定濃度的(100.2±5.78)%，表明反復(fù)凍融后的樣品表現(xiàn)較穩(wěn)定。另取按“2.3”項下方法處理后的待測樣品，置室溫條件下考察放置穩(wěn)定性。結(jié)果濃度為1 μmol·L-1的 MTX 標準血樣在處理后 0、8、24 h 三個時間點測得的濃度分別為 0.996、1.003、0.998 μmol·L-1，平均(0.999 ±0.02)μmol·L-1，RSD=3.45%，說明處理后的待測樣品室溫放置24 h內(nèi)也較穩(wěn)定。

2.9 實驗室質(zhì)控方法 本實驗室MTX血藥濃度監(jiān)測的方法學(xué)3個月更新一次，每次均重復(fù)本文2.5至2.8中標準曲線的制作、精密度、回收率、穩(wěn)定性實驗，確保標準曲線的線性關(guān)系良好。另外，在監(jiān)測患者的血藥濃度的過程中，我們都會測定一個已知濃度的MTX血樣作為質(zhì)控，以確保患者血藥濃度監(jiān)測的數(shù)據(jù)準確。2.5至2.8中方法學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)為2014年8月份最近一次的結(jié)果。

2.10 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學(xué)處理 所有患者按用藥結(jié)束后20、44 h的MTX血藥濃度與肝腎功能各項指標進行相關(guān)分析。統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0軟件。計量資料以±s表示。采用Spearman相關(guān)分析兩變量間相關(guān)性。

3 結(jié)果

3.1 22例次血藥資料 選22例次資料齊全的ALL患者采用HD-MTX+CF方案化療后MTX血藥濃度監(jiān)測的結(jié)果:用藥結(jié)束后0 h的MTX有效濃度為(52.99 ±22.59)μmol·L-1，20 h 及44 h 的血藥濃度分別為(3.42 ± 7.64)μmol·L-1、(0.53 ±0.99)μmol·L-1。

3.2 MTX 20 h、44 h血藥濃度與腎損害的關(guān)系22例ALL患者中有9例次在20 h出現(xiàn)MTX體內(nèi)蓄積，有10例次在44 h出現(xiàn)MTX體內(nèi)蓄積。

Spearman相關(guān)分析顯示:化療后20 h血MTX濃度與患者化療后肌酐(CRE)值呈正相關(guān)(r=0.657，P ＜0.01)，而與尿素氮(BUN)值、尿酸(UA)值無關(guān)，見圖1。

化療后44 h血MTX濃度也與患者化療后CRE呈正相關(guān)(r=0.749，P ＜0.01)，而與 BUN 值、UA值無關(guān)，如圖2。

3.3 MTX 20 h、44 h血藥濃度與肝功能指標的關(guān)系22例ALL患者化療后有5例次出現(xiàn)總膽紅素(STB)偏高的現(xiàn)象，12例次直接膽紅素(DBIL)明顯升高，2例次谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)偏高，4例次谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)偏高。

Spearman相關(guān)分析顯示:化療后20 h血MTX濃度與患者化療后 DBIL值呈正相關(guān)(r=0.562，P＜0.01)，與 STB 呈正相關(guān)(r=0.533，P ＜0.01)，與ALT值也呈正相關(guān)(r=0.450，P ＜0.05)，與 AST 呈正相關(guān)(r=0.439，P ＜0.05)，見圖3 ～6。

而化療后44h血MTX濃度與患者化療后STB、DBIL、ALT、AST 值均無關(guān)。

4 討論

MTX的細胞毒作用是非選擇性的，在抑制腫瘤細胞的同時也增加了對機體正常細胞的毒性。為減少MTX的毒副作用，需要使用CF解救，而CF解救MTX引起的不良反應(yīng)同時，也一定程度抵消了MTX的抗白血病作用。因此根據(jù)MTX的血藥濃度適度適量的CF解救至關(guān)重要［2-3］。

本研究的結(jié)果顯示MTX 20、44 h血藥濃度與患者化療后血CRE值呈正相關(guān)。這說明，對于ALL患者腎功能損害，MTX 20、44 h血藥濃度均有明顯的預(yù)測作用。另有虞國慧等的研究［4］稱44 h血藥濃度與化療前血CRE值呈正相關(guān)。Holmboe等的研究［5］稱MTX主要由肝臟代謝為7-OH-MTX，由腎臟主要以原型清除，MTX的排泄延遲會加重腎功能受損。我們可以推論，腎功能不全和MTX的排泄延遲是互為因果的，化療前腎功能不全會引起MTX的排泄延遲，而MTX排泄延遲會進一步引起腎功能損害。因此，腎功能不全的患者使用MTX化療時應(yīng)慎重。如果患者出現(xiàn)MTX排泄延遲會應(yīng)及時水化、堿化尿液、增加CF解救劑量，以緩解MTX的細胞毒性，同時檢查肝腎功能指標，嚴重時考慮血液透析，降低血液MTX水平。給予carboxypeptidase 2(CPDG2，羧肽酶)已得到證實可在15 min內(nèi)有效降低MTX水平(95.6% ～99.6%)。CPDG2通過水解MTX為無活性的代謝產(chǎn)物(DAMPA和谷氨酸)，而發(fā)揮作用。因此，如果能在早期給予CPDG2，可能不再需要透析治療［6-7］。但目前，CPDG2的使用仍屬研究階段，未在臨床廣泛使用。

本研究的結(jié)果還顯示MTX 20 h血藥濃度與患者化療后血 STB、DBIL、ALT、AST 值均呈正相關(guān)，而44 h血 MTX 濃度與 STB、DBIL、ALT、AST 值無相關(guān)性。這說明，對于應(yīng)用HD-MTX化療的ALL患者造成肝損害，MTX 20 h血藥濃度監(jiān)測具有預(yù)測作用。MTX造成的肝臟損害可能是急性的、可恢復(fù)的，MTX在化療20 h時對患者造成的肝損害到第3天44 h時，隨MTX的消除肝功能得到了恢復(fù)。

MTX造成不良反應(yīng)的作用機理尚不完全明確。國外研究表明，HD-MTX給藥后引起的急性肝臟毒性與MTX在機體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物7-OH-MTX濃度有關(guān)［5］。另有研究表明，MTX治療ALL的療效和毒副作用可能與胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)基因(TYMS)［8-11］及絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶 1(serine hydroxymethyltransferase 1，SHMT1)［12］多態(tài)性有關(guān)。

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