王庭柱，郭永麗，高明春，羅修鑫，安東，劉瑩，師東方*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)墾總局建三江管理局八五九農(nóng)場，黑龍江雙鴨山 156326）

牛IFN-ε基因克隆、表達與抗病毒活性分析

王庭柱1,2，郭永麗1，高明春1，羅修鑫1，安東1，劉瑩1，師東方1*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)墾總局建三江管理局八五九農(nóng)場，黑龍江雙鴨山 156326）

為分析預(yù)測牛IFN-ε基因功能及特性，研究首先從牛肝基因組中克隆該基因，推導(dǎo)牛IFN-ε基因?qū)?yīng)氨基酸并作生物信息學分析，在mRNA水平驗證牛IFN-ε基因為可轉(zhuǎn)錄基因。構(gòu)建包含牛IFN-ε成熟肽基因的原核表達載體pET32a-BoNE，將重組載體轉(zhuǎn)移至大腸桿菌RosettaTM（DE3）pLysS，IPTG誘導(dǎo)表達，融合蛋白rBoNE主要以包涵體形式存在。結(jié)果表明，經(jīng)MDBK-VSV干擾素活性系統(tǒng)檢測，牛IFN-ε融合蛋白具有抗病毒活性。組織分布表明，其可在肝、腎、胸腺、小腸以及睪丸中組成性表達，但心臟未見表達。

牛IFN-ε；克隆表達；融合蛋白；抗病毒活性

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-12-28 12:54:15[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151228.1254.002.html

王庭柱,郭永麗,高明春,等.牛IFN-ε基因克隆、表達與抗病毒活性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2015,46(12):39-44.

Wang Tingzhu,Guo Yongli,Gao Mingchun,et al.Cloning,expression and antiviral activity analysis of bovineIFN-ε[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(12):39-44.(in Chinese with English abstract)

IFN-ε是Ⅰ型干擾素重要成員。與IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-ω、IFN-ε、IFN-δ、IFN-αω、 IFN-ν、IFN-τ、IFN-ζ（或者Limitin）等具有相同受體類型、基因座位點及相似蛋白結(jié)構(gòu)[1-3]。IFN-ε含192個氨基酸，與IFN-β蛋白結(jié)構(gòu)相似[1]。與其他Ⅰ型干擾素不同，IFN-ε可持續(xù)表達于肺、腦、小腸和生殖組織[1,4]，與IFN-α2b相比具有較低抗病毒、抗增殖和自然殺傷細胞增殖活性[5]，但在胎生哺乳動物抗病毒保護和早期胎盤發(fā)育中均具有重要作用[1,6-8]

IFN-ε研究日趨完善[3,9-12]，人、鼠、豬和狗的IFN-ε已見報道[1,3,9-14]，但生物學活性研究較少。牛Ⅰ型干擾素研究有限，尤其是牛IFN-ε，其正常生理條件下能否組成型表達、生理與免疫學功能目前仍未可知。本研究克隆并表達牛IFN-ε，并測定其抗病毒活性、生理條件下組織分布狀態(tài)，為反芻動物IFN-ε深入研究提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、載體和試劑

原核表達載體pET-32a(+)購自Novagen公司；大腸桿菌RosettaTM(DE3)pLysS和TG1感受態(tài)細胞由東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院微生物教研室保存；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；PFU高保真性DNA聚合酶購自北京天根生化科技有限公司；DNA Marker、pMD18 T載體、rTaq、Primestar DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購自大連TaKaRa工程有限公司；pEASY Blunt T載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京碧云天有限公司；Ni-NTA純化試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.2細胞和病毒

荷斯坦奶牛肝組織采自黑龍江哈爾濱綜合牧場；VSV病毒購自中國獸藥監(jiān)察所；MDBK細胞和EBK細胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈。

1.2方法

1.2.1牛IFN-ε基因定位與克隆

參照分子克隆指南提取牛肝基因組[15]。NCBI上搜索IFN-ε基因成熟肽序列，將其在?；蚪M序列上定位分析，得出?；蚪M上IFN-ε基因序列。根據(jù)得到的基因序列設(shè)計包括牛IFN-ε在內(nèi)的特異性上游引物BoIFNES：5'GGTGCTGCTAAGCCTCT GA 3'和下游引物BoIFNEA：5'CAGTCGGCTGTTC CTTCAC 3'。以提取牛肝基因組為模板，PCR擴增目的片段，反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s，52～62℃30 s，72℃40 s，30個循環(huán)；72℃10 min。膠回收擴增目的片段，連接至pEASY Blunt-T載體，酶切鑒定正確后測序分析。

1.2.2牛IFN-ε基因序列分析

通過網(wǎng)站預(yù)測軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/）分析牛IFN-ε開放性閱讀框架（ORF），同時使用Lasergene 11軟件包（DNAStar,Inc.,USA）和ClustalX軟件分析牛IFN-ε氨基酸序列并作序列比對分析，通過ClustalX和MEGA 5.0作進化樹構(gòu)建分析[16]。

使用在線軟件預(yù)測牛IFN-ε糖基化位點（http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetGlycate/）及二級結(jié)構(gòu)（http:// www.npsa-pbil.ibcp.fr.）。

1.2.3牛IFN-ε基因mRNA轉(zhuǎn)錄分析

EBK細胞提前24 h鋪板，待單層細胞長至細胞板80%～90%時，加入1∶100倍稀釋的VSV病毒感染1.5 h，換取細胞維持液。VSV感染EBK細胞后6 h收獲細胞，參照說明書使用Trizol試劑提取細胞總RNA，DNase I處理后使用引物BoIFNEA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。以此為模板，特異性鑒定上游引物BoNE-RNAA1：5'AGACCTCGTCAGT TCAGCAG 3'以及下游引物BONE-RNAA2：5'GA CAATAGTCCAGGCACAGC 3'擴增目的基因片段，PCR反應(yīng)條件同上。膠回收擴增目的片段，連接至pMD18 T載體，酶切鑒定正確后測序分析。

1.2.4牛IFN-ε原核表達載體構(gòu)建

設(shè)計原核表達特異性引物BoNEORFEI：5' TGTTGAATTCEcoRⅠCAAGAGCTGAAACTGGTT 3'和BoNEORFXI：5'TCACTCGAGXhoITCAAGTTTCC ATGCCCTGT 3'擴增牛IFN-ε成熟肽序列，PCR反應(yīng)條件同上。將PCR產(chǎn)物與pET-32a(+)質(zhì)粒分別用Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收并T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至TG1感受態(tài)中，經(jīng)酶切鑒定陽性質(zhì)粒，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET32a-BoNE。

1.2.5融合蛋白rBoNE表達與純化

將pET32a-BoNE轉(zhuǎn)化RosettaTM（DE3）pLysS感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達6 h，重懸菌體后在冰浴條件下超聲裂解，取沉淀和上清SDS-PAGE分析，將融合蛋白命名為rBoNE[17]。大劑量誘導(dǎo)后用Ni-NTA親和層析純化目的蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定純化后蛋白濃度，SDS-PAGE檢測。

1.2.6融合蛋白rBoNE抗病毒活性分析

96孔細胞培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)MDBK細胞至單層后，每孔加入100 μL4倍稀釋的rBoNE，37℃孵育24 h后用100 TCID50VSV攻毒，24～48 h后觀察細胞病變抑制結(jié)果，同時設(shè)細胞對照和病毒對照。以抑制50%細胞病變（CPE50）的最高干擾素稀釋度為1個活性單位（U）[18]。

1.2.7牛IFN-ε組織分析

取成年牛心、肝、腎、胸腺、小腸、睪丸等組織提取RNA，使用引物BoIFNE-A2反轉(zhuǎn)錄，DNase I處理后使用引物BoIFNEA反轉(zhuǎn)錄，BoNE-RNAA1和BONE-RNAA2為引物PCR擴增。同時以牛GAPDH基因作為內(nèi)參，檢測牛IFN-ε基因在組織中分布情況。

2　結(jié)果與分析

2.1目的基因擴增與序列分析

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，片段大小約1 000 bp，與預(yù)期大?。? 073 bp）一致（見圖1）；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定分析后均與預(yù)期相符，測序結(jié)果經(jīng)比對分析，與參考基因片段相似性達99.81%，其中ORF區(qū)氨基酸相似性達100%。ORF區(qū)包含一個21 aa組成信號肽序列以及172 aa成熟肽序列，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小為22.694 ku，等電點為8.34。

圖1　牛IFN-ε PCR擴增產(chǎn)物Fig.1PCR product of bovine IFN-ε

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，牛IFN-ε有5個潛在α螺旋，與人和鼠IFN-ε結(jié)果一致。牛IFN-ε無N-糖基化位點，存在7個潛在O-糖基化位點，這些位點在蛋白折疊、寡聚化和穩(wěn)定性方面起重要作用[19]。進化分析結(jié)果表明，牛IFN-ε與其他動物IFN-ε親緣關(guān)系較近，可能是由一個共同的祖先分子進化而來（見圖2）。另外進化樹構(gòu)建分析的序列共分3個進化分支：Ⅰ型干擾素、Ⅱ型干擾素和Ⅲ型干擾素，且IFN-ε屬于Ⅰ型干擾素。

圖2　牛IFN-ε進化分析Fig.2Phylogenetic analysis of bovine IFN-ε

2.2牛IFN-ε轉(zhuǎn)錄分析

EBK細胞感染VSV 6 h后，RT-PCR可檢測到牛IFN-ε基因轉(zhuǎn)錄（見圖3a），牛IFN-ε mRNA來源序列與基因組來源序列一致（見圖3b）。

圖3　牛IFN-ε的mRNA轉(zhuǎn)錄分析及鑒定Fig.3mRNA transcription analysis and identification of bovine IFN-ε

2.3牛IFN-ε表達載體構(gòu)建與鑒定

以pEASY-BoNE為模板，上下游引物BoNE?ORFEI和BoNEORFXI擴增出約530 bp基因片段，與預(yù)期目的片段相符（見圖4a）。然后以相似方式連接到pET32a載體（見圖4b）。

圖4　重組質(zhì)粒PCR擴增和鑒定Fig.4PCR and restriction digestion analysis of pET32a-BoNE

2.4融合蛋白rBoNE表達與純化

SDS-PAGE結(jié)果表明，重組菌在分子質(zhì)量約25 ku處有特異性蛋白條帶，與預(yù)期分子質(zhì)量一致，并且表達的融合蛋白主要以包涵體形式存在（見圖5a）。rBoNE經(jīng)Ni-NTA親和層析純化顯示清晰單一條帶（見圖5b），BCA法測定純化蛋白濃度為0.528 mg·mL-1。

圖5　rBoNE誘導(dǎo)表達可溶性分析及純化Fig.5SDS-PAGE analysis of recombinant protein rBoNE

2.5融合蛋白rBoNE抗病毒活性分析

抗病毒活性試驗表明，MDBK細胞對照組生長良好（見圖6a），rBoNE處理后（經(jīng)計算，活性為6.7×103U·mL-1），能抵抗100TCID50病毒攻擊（見圖6b），而病毒對照組細胞全部死亡（見圖6c），說明純化獲得融合蛋白rBoNE具有較好抗病毒活性。

2.6牛IFN-ε組織分布

半定量RT-PCR結(jié)果表明，BoIFN-ε可在生理條件下持續(xù)性表達于肝、脾、腎、小腸、睪丸，而心臟未見表達。BoIFN-α在上述組織中均不表達，GAPDH內(nèi)參結(jié)果顯示從肺中提取RNA失?。ㄒ妶D7）。

圖6　融合蛋白rBoNE抗病毒分析Fig.6Antiviral activity analysis of rBoNE

圖7　BoIFN-ε組織分布Fig.7Tissue analysis of BoIFN-ε

3　討論

IFN-ε可表達于各種細胞，但是在生殖組織中發(fā)揮病毒保護還是在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用仍無定論[7,20]。Ⅰ型干擾素各型之間結(jié)構(gòu)類似，均為無內(nèi)含子的單拷貝或多拷貝基因[21]。所以本試驗從牛肝基因組中克隆獲得IFN-ε基因，采用RT-PCR方法證明牛IFN-ε為可轉(zhuǎn)錄基因。生物信息學分析結(jié)果表明，牛IFN-ε與豬IFN-ε同源性為87.1%，與其他動物IFN-ε在相同位置有高度保守的氨基酸位點，具有保守的半胱氨酸，可形成一個二硫鍵，有潛在糖基化位點可形成糖蛋白，具有5個α螺旋，這些特性均屬于Ⅰ型干擾素典型特征。另外進化分析表明，牛IFN-ε與其他動物IFN-ε屬于同一進化分支，且屬于牛Ⅰ型干擾素分支。

IFN-ε多分布在生殖組織，人IFN-ε顯著表達于子宮、子宮頸、陰道和卵巢[22]，鼠IFN-ε表達于卵巢、子宮、纖維母細胞、肺、腦、腎上腺及心臟，但胸腺、脾、睪丸、肝和腎中未見表達[1]。恒河猴IFN-ε表達于子宮、卵巢和睪丸，在心臟、胸腺、腸、腎、腦和脊髓中也有表達[23]，豬IFN-ε可表達于皮膚、腸、腸系膜淋巴結(jié)、睪丸、脾和外周血淋巴細胞，但腸、腸系膜淋巴結(jié)和皮膚表達量較高[14]。牛IFN-ε可表達于肝、脾、腎、腸、睪丸中，而心臟未見表達，可能與不同物種IFN-ε組織表達分布不同有關(guān)。

本研究通過細胞病變抑制法，選用牛源細胞MDBK和測定干擾素活性的標準病毒VSV作為抗病毒檢測系統(tǒng)，檢測融合蛋白rBoNE活性。結(jié)果表明融合蛋白在MDBK細胞上具有抗病毒活性，為今后獲得重組牛IFN-ε奠定基礎(chǔ)。為牛Ⅰ型干擾素研究提供理論基礎(chǔ)，而有關(guān)牛IFN-ε具體功能有待進一步研究。

4　結(jié)論

a.克隆得到牛IFN-ε，該分子具有典型的I型干擾素分子特征。

b.牛IFN-ε在細胞水平具有抗病毒活性。

c.牛IFN-ε為組成型表達，分布于肝、脾、腎、腸、睪丸中。

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Cloning,expression and antiviral activity analysis of bovineIFN-ε

WANG Tingzhu1,2,GUO Yongli1,GAO Mingchun1,LUO Xiuxin1,AN Dong1,LIU Ying1,SHI Dongfang1（1.School of Veterinary Medicines,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.859 Farm of Jiansanjiang Administration,Agricultural Reclamation Administration of Heilongjiang Province,Shuangyashan Heilongjiang 156326,China)

In order to analyze the functions and characterization of predicted bovineIFN-εgene,a novel bovineIFN-εgene was cloned from bovine liver genome,the corresponding amino acids were deduced and the characterization was analyzed with bioinformatics software,and bovineIFN-εwas verified to be the transcribed gene at the mRNA level.Then the prokaryotic expression vector pET32a-BoNE containing the mature peptide gene of bovine IFN-ε was constructed,and the recombinant vector was transformed intoE.coliRosettaTM(DE3)pLysS.After IPTG induction,the fusion protein rBoNE mainly expressed as the insoluble form.The results showed antiviral activity was analyzed by MDBK-VSV system, the result revealed that bovineIFN-εhad antiviral activity.Tissue distribution showed that bovine IFN-ε could be expressed constitutively in liver,kidney,thymus,small intestine and testis,but not expressed in the heart.

bovineIFN-ε;cloning and expression;fusion protein;antiviral activity

S852.4+2

A

1005-9369（2015）12-0039-06

2015-04-15

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-37）；國家科技支撐計劃項目（2012BAD12B05，2012BAD12B03）

王庭柱（1980-），男，博士研究生，研究方向為奶牛疫病防控。E-mail:wangtingzhu1980@163.com

師東方，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為畜禽傳染病免疫防控。E-mail:shi_df@163.com