胥偉，王海濱，黃迪，向濤，許亞彬

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023）

糖基化反應(yīng)過(guò)程中卵白蛋白分子特性變化研究

胥偉，王海濱，黃迪，向濤，許亞彬

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023）

以蛋清卵白蛋白糖基化產(chǎn)物為研究對(duì)象，監(jiān)測(cè)糖基化反應(yīng)過(guò)程中蛋白分子特性變化。發(fā)現(xiàn)隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，卵白蛋白與單糖或多糖反應(yīng)產(chǎn)物接枝度均逐漸增大，且相同反應(yīng)條件下，卵白蛋白與單糖反應(yīng)產(chǎn)物接枝度較大；糖基化卵白蛋白表面巰基相對(duì)含量前3 d逐漸增加，第4天達(dá)最大值，糖基化卵白蛋白表面巰基相對(duì)含量始終高于卵白蛋白。1～3 d內(nèi)，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，糖基化卵白蛋白疏水性不斷增加，反應(yīng)3 d后，糖基化卵白蛋白疏水性則明顯下降；反應(yīng)體系中大體積粒子數(shù)隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，且前3 d較大面積的粒子數(shù)增速較快。圓二色譜研究結(jié)果表明，隨糖基化反應(yīng)進(jìn)行，α螺旋含量逐漸減小，β折疊與β轉(zhuǎn)角含量不斷增加；無(wú)規(guī)則卷曲含量呈波浪式變化，β折疊含量變化最大。結(jié)果表明，糖基化反應(yīng)可提高蛋清卵白蛋白疏水性和分子粒徑，使蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。

卵白蛋白；糖基化反應(yīng)；分子特性

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2015-12-25 13:11:04[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151225.1311.044.html

胥偉,王海濱,黃迪,等.糖基化反應(yīng)過(guò)程中卵白蛋白分子特性變化研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(12):33-38.

Xu Wei,Wang Haibin,Huang Di,et al.Study on ovalbumin molecular properties changes in the process of glycation reaction[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(12):33-38.(in Chinese with English abstract)

蛋清蛋白具有多種功能性質(zhì)（如凝膠性、起泡性、乳化性等），廣泛用于食品工業(yè)[1]，其中卵白蛋白是蛋清中含量最多的蛋白質(zhì)，占蛋清蛋白總量54%。卵白蛋白分子質(zhì)量為44.5 ku，等電點(diǎn)為4.5，是一種單體、球形磷酸糖蛋白，由385個(gè)氨基酸殘基組成，其中疏水性氨基酸占50%以上，碳水化合物比例占3.5%，是蛋清蛋白中唯一具有游離巰基的蛋白質(zhì)，每1分子卵白蛋白中含有4個(gè)巰基和1個(gè)二硫鍵[2]。

王喜波等研究表明，通過(guò)改變蛋白分子物可改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)[3]，如卵白蛋白與右旋糖苷在60℃、濕度大于75%條件下、反應(yīng)3周以上可制得卵白蛋白-右旋糖苷共軛物，該產(chǎn)物具有良好的乳化性[4]。卵白蛋白糖基化反應(yīng)后功能性研究已有報(bào)道[1]，但關(guān)于糖基化反應(yīng)過(guò)程中蛋白分子特性研究鮮見報(bào)道，本研究以蛋清卵白蛋白與葡聚糖為反應(yīng)物，研究糖基化反應(yīng)過(guò)程中蛋白分子特性變化，為揭示卵白蛋白糖基化反應(yīng)進(jìn)程及其應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試劑

卵白蛋白：Sigma試劑公司；β-葡聚糖：濟(jì)南昌諾生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TNBS（三硝基苯磺酸）：上海寶曼生物科技有限公司；DTNB（5，5'-二硫代雙-2-硝基苯甲酸）：北京索萊寶科技有限公司；1，8-ANS（8-苯胺-1-萘磺酸）：上海皓塵生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

ALC-310.3電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；722-2000型分光光度計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；

BI-200SM靜態(tài)激光散射儀：美國(guó)布魯克海文公司；S-3400N掃描電鏡：日本日立公司；JASCOJ-815圓二色光譜：日本JASCO公司。

1.3方法

1.3.1糖基化卵白蛋白制備

將葡萄糖、葡聚糖分別與卵白蛋白以8∶100混合，置于恒溫恒濕箱中，反應(yīng)溫度70℃，相對(duì)濕度74%，反應(yīng)時(shí)間1～5 d，每隔1 d取出等量樣品置于干燥器于冰箱中（4℃）存放待用[5]。

1.3.2接枝度測(cè)定

用去離子水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%糖基化蛋白樣品溶液，取0.5 mL該溶液，依次加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaHCO3溶液，0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS溶液和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%TNBS溶液，混勻后40℃下避光保溫2 h，加入1 mol·L-1HCl溶液0.25 mL和0.01 mol·L-1HCl溶液2.25 mL，混勻后在340 nm下測(cè)定吸光值，將卵白蛋白樣品作為空白，接枝度計(jì)算公式如下：

其中，A-340 nm下吸光值；C-蛋白樣品濃度（g·mL-1）。

1.3.3巰基相對(duì)含量測(cè)定

表面巰基相對(duì)含量測(cè)定：取濃度為0.1 mol·L-1Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.0，含0.01 mol·L-1EDTA）4 mL加入到1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%蛋白溶液中，40℃下保溫30 min后加入125 μL DTNB試劑中，在25℃顯色10 min，測(cè)定412 nm下吸光值，以不加樣品Ellman試劑作空白對(duì)照，計(jì)算公式如下：

其中，ΔA為加DTNB試劑樣品吸光值與不加DTNB試劑樣品吸光值之差；C-樣品濃度（g·mL-1）。

總巰基相對(duì)含量測(cè)定：在Tris-甘氨酸緩沖液中添加0.25%SDS使其蛋白變性，將內(nèi)部巰基暴露，蛋白質(zhì)溶液濃度改為0.4%，其他同表面巰基測(cè)定。

1.3.4蛋白疏水性測(cè)定

參考Sun和Nakai方法[6-7]，用pH 7.4濃度0.02 mol·L-1磷酸緩沖液配制濃度0.1%～0.5%蛋白溶液，取不同濃度樣品溶液4 mL，加入20 μL ANS溶液（以pH 7.4磷酸緩沖液作溶劑，濃度0.02 mol·L-1）作為熒光探針在25℃下保持1 h。在370 nm激發(fā)波長(zhǎng)和470 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，蛋白溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制曲線，曲線斜率即為蛋白分子表面疏水性。

1.3.5粒徑分析

根據(jù)Schwenke和Easa等方法[7-8]，并稍作改動(dòng)。稱取0.2 g樣品，溶于20 mL pH 7.0濃度為0.1 mol·L-1磷酸緩沖液中，磁力攪拌使其充分溶解，靜態(tài)激光散射儀測(cè)定粒徑分布。操作條件：介質(zhì)：水溶液；掃描角度90°；溫度25℃；波長(zhǎng)632.8 nm。

1.3.6圓二色譜分析

JASCOJ-810旋光儀分析卵白蛋白與糖基化卵白蛋白遠(yuǎn)紫外圓二色譜。具體操作如下：將蛋白溶液移至0.1 cm厚橢圓形比色皿中，25℃下連續(xù)充氮在190～250 nm掃描區(qū)間下遠(yuǎn)紫外區(qū)域掃描，掃描參數(shù)為：V=50 nm·min-1，間隔0.1 nm，累積3次掃描結(jié)果?？朔肿訖E圓率[θ]計(jì)算公式如下：

θ-CD儀測(cè)出橢圓率（mdeg）；C-胰蛋白酶抑制劑濃度（mol·L-1）；L-比色皿厚度（cm）。

由The Model JWssE-480 Protein secondary Strueture Estimation Program軟件，參照Yang氏CD光譜估算糖基化卵白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋，β折疊，β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲所占比率。

1.3.7熒光光譜分析

將蛋白樣品溶于pH 7.0濃度為0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液中，蛋白質(zhì)溶液濃度為0.5 mg·mL-1，以pH 7.0濃度為0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作空白參比，檢測(cè)參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)（280 nm），發(fā)射光譜掃描范圍（300～380 nm）。

2　結(jié)果與分析

2.1糖基化卵白蛋白接枝度分析

為分析卵白蛋白與多糖和單糖發(fā)生糖基化反應(yīng)時(shí)接枝度變化的差異性，選用葡萄糖作空白對(duì)照，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間卵白蛋白-葡聚糖接枝產(chǎn)物和卵白蛋白-葡萄糖接枝產(chǎn)物（糖添加量為8%，反應(yīng)溫度70℃，相對(duì)濕度74%，反應(yīng)時(shí)間1～5 d）接枝度，結(jié)果如圖1所示。

圖1　糖基化卵白蛋白接枝度變化Fig.1Change of glacated OVA grafting percentage

在1～5d隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，卵白蛋白與單糖和多糖接枝產(chǎn)物接枝度逐漸增大。

2.2糖基化卵白蛋白巰基相對(duì)含量變化

糖基化卵白蛋白表面巰基相對(duì)含量變化可反映巰基對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響，蛋白巰基相對(duì)含量變化如圖2所示，本試驗(yàn)所用多糖為葡聚糖。卵白蛋白在相對(duì)濕度74%、70℃條件下反應(yīng)1～5 d，蛋白巰基相對(duì)含量隨反應(yīng)時(shí)間變化如圖2（左）所示?？芍砻鎺€基相對(duì)含量在前3 d逐漸增加，第4天達(dá)最大。

2.3糖基化卵白蛋白疏水性變化

采用ANS作為熒光探針測(cè)定糖基化蛋白疏水性，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨蛋白質(zhì)濃度增加，熒光強(qiáng)度呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，此方法可較好反映蛋白質(zhì)表面疏水性。在1～3 d，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，糖基化卵白蛋白疏水性不斷增加。Shirai等認(rèn)為未改性卵白蛋白中有許多疏水基團(tuán)[9]，大多數(shù)位于蛋白分子內(nèi)部，糖基化反應(yīng)使包埋于天然態(tài)卵白蛋白分子內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，使蛋白結(jié)構(gòu)伸展。3 d后糖基化卵白蛋白疏水性明顯降低。

圖2　糖基化卵白蛋白巰基相對(duì)含量變化Fig.2Change of sulfhydryl groups content of glycated ovalbmin

圖3　糖基化卵白蛋白疏水性變化Fig.3Hydrophobicity of glycated ovalbumin during incubation

2.4糖基化卵白蛋白溶液粒徑分析

糖基化反應(yīng)過(guò)程中，蛋白分子大小及形狀隨糖基化反應(yīng)程度變化，采用靜態(tài)激光散射儀研究不同反應(yīng)時(shí)期糖基化卵白蛋白粒徑分布，結(jié)果如表1所示。

D[4，3]表征分子體積，由表1可知，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)體系中大體積粒子數(shù)逐漸增加。D [3，2]表征分子面積，反應(yīng)前3 d，具有較大面積粒子數(shù)量增速較快，主要由于多糖與蛋白連接使蛋白分子面積增大，后續(xù)反應(yīng)過(guò)程中，蛋白伸展對(duì)蛋白分子面積影響很小故增速緩慢。

2.5熒光光譜分析

美拉德反應(yīng)高級(jí)階段產(chǎn)物具有較強(qiáng)熒光特性[10]，在激發(fā)波長(zhǎng)為347 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm下有較強(qiáng)吸收。這一特性不同于蛋白質(zhì)色氨酸殘基熒光特性（激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)336 nm），美拉德高級(jí)階段的熒光特性由美拉德反應(yīng)過(guò)程中生成小分子中間產(chǎn)物造成。通過(guò)對(duì)卵白蛋白樣品溶液熒光性分析可以判斷美拉德反應(yīng)高級(jí)階段進(jìn)行程度。此外，熒光光譜可用于分析糖基化卵白蛋白在反應(yīng)過(guò)程中結(jié)構(gòu)變化，在激發(fā)波長(zhǎng)347 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定糖基化卵白蛋白熒光強(qiáng)度，并在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm下，掃描區(qū)間300～400 nm色氨酸熒光光譜，對(duì)結(jié)果分析如圖4所示。

由圖4可知，糖基化反應(yīng)3 d，蛋白熒光強(qiáng)度并無(wú)顯著變化，說(shuō)明此時(shí)體系主要處于美拉德反應(yīng)初級(jí)階段，但當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到第4、5天時(shí)，熒光強(qiáng)度增幅劇烈。

表1　糖基化卵白蛋白平均粒徑變化Table 1Mean particle size of glycated ovalbumin

圖4　糖基化反應(yīng)過(guò)程中卵白蛋白熒光強(qiáng)度Fig.4Fluorescence of glycated ovalbumin during incubation

圖5是在激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)336 nm條件下測(cè)定的色氨酸熒光光譜，圖中1為天然態(tài)的卵白蛋白，2為不加糖僅在糖基化反應(yīng)條件下放置3 d卵白蛋白，3為糖基化反應(yīng)3 d后的卵白蛋白?？芍腔磻?yīng)使色氨酸熒光光譜發(fā)生明顯變化，糖基化反應(yīng)可部分改變卵白蛋白側(cè)鏈基團(tuán)，導(dǎo)致色氨酸殘基所處微環(huán)境發(fā)生改變。

圖5　卵白蛋白與糖基化卵白蛋白色氨酸熒光光譜Fig.5Tryptophan fluorescence spectra of ovalbumin and glycated ovalbumin

2.6圓二色譜分析

蛋白質(zhì)圓二色性被廣泛用于蛋白質(zhì)分子構(gòu)象檢測(cè)。采用圓二色譜分析糖基化卵白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如表2所示。

隨糖基化反應(yīng)進(jìn)行，α螺旋含量逐漸減小；β折疊與β轉(zhuǎn)角含量不斷增加；無(wú)規(guī)則卷曲含量呈波浪式變化，其中β折疊含量變化最大。

表2　糖基化卵白蛋白各構(gòu)象含量分析Table 2Composition of the structure of glycated ovalbumin (%)

3　討論與結(jié)論

相同反應(yīng)時(shí)間下卵白蛋白與單糖反應(yīng)產(chǎn)物比多糖反應(yīng)產(chǎn)物接枝度大，因?yàn)槠暇厶欠肿淤|(zhì)量較大，對(duì)其醛基末端與卵白蛋白游離氨基之間羰胺反應(yīng)空間位阻較大。反應(yīng)過(guò)程中，糖基化卵白蛋白表面巰基相對(duì)含量始終高于未改性卵白蛋白，因?yàn)橐环矫嫣腔磻?yīng)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白伸展程度增加，將處于分子內(nèi)部巰基基團(tuán)暴露在蛋白表面，使表面巰基相對(duì)含量增加。另一方面暴露在分子表面巰基在此反應(yīng)條件下反應(yīng)活性增強(qiáng)，易于轉(zhuǎn)化成二硫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致巰基相對(duì)含量下降。由圖2（右）可知，糖基化卵白蛋白總巰基相對(duì)含量始終高于未改性卵白蛋白總巰基相對(duì)含量，但與表面巰基變化不同，總巰基相對(duì)含量隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低。反應(yīng)3 d后糖基化卵白蛋白疏水性明顯降低，是由于已伸展疏水基團(tuán)之間相互作用形成疏水鍵，蛋白分子表面疏水基團(tuán)相互聚集，通過(guò)疏水相互作用，蛋白單體形成多聚體，進(jìn)而使蛋白表面疏水性不斷下降。本試驗(yàn)中反應(yīng)前3 d美拉德反應(yīng)速度（高級(jí)階段）非常緩慢，進(jìn)入第4天后，美拉德反應(yīng)速度（高級(jí)階段）急劇加快，這一趨勢(shì)與王玉堃使用葡萄糖改性所測(cè)結(jié)果不同[5]，造成差異原因是本研究中采用多糖，反應(yīng)用糖分子質(zhì)量越大，美拉德反應(yīng)進(jìn)入高級(jí)階段越遲。

隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，卵白蛋白與單糖或多糖反應(yīng)產(chǎn)物接枝度均逐漸增大，且相同反應(yīng)時(shí)間與單糖反應(yīng)產(chǎn)物接枝度較大。隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，α螺旋含量逐漸減小，β折疊與β轉(zhuǎn)角含量不斷增加，無(wú)規(guī)則卷曲含量呈波浪式變化，其中β折疊含量變化最大。

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Study on ovalbumin molecular properties changes in the process of glycation reaction

XU Wei,WANG Haibin,HUANG Di,XIANG Tao,XU Yabin(School of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

With egg white ovalbumin glycosylation reaction product as the research object, monitoring glycosylation reaction process,changes in the protein molecular characteristics.Experimental results showed that with prolongation of reaction time,ovalbumin and monosaccharide and polysaccharide of reaction product grafting degree increased gradually,and the same reaction time and reactions of monosaccharide graft copolymer was larger;glycosylated ovalbumin surface thiol relative content of 3 days before gradually increased,the 4 day reached maximum value,and the relative content of glycosylated ovalbumin surface thiol was always higher than that of ovalbumin.In 1-3 days, with the extension of reaction time,the hydrophobicity of the glycosylated albumin increased significantly,and the hydrophobicity of the 3 days later,the size of the large volume of the reaction system increased gradually with the increase of the reaction time,and the first 3 days with a large area of the rapid increase in particle number.Experimental results showed that,glycosylation could improve the hydrophobicity and molecular size of ovalbumin.Determined the secondary structure of ovalbumin before and after the glycosylation reaction,infrared spectroscopy and circular dichroism analysisshowed that the glycosylation reaction to ovalbumin α-helix content decreases gradually;β-sheet was theβ-turn content continues to increase;coil content with the wavy changes in reaction time,the greatest change in theβ-sheet content.

ovalbumin;glycation reaction;molecular properties

TQ64

A

1005-9369（2015）12-0033-06

2015-08-15

湖北省教育廳科技研究計(jì)劃青年人才項(xiàng)目（532109015012）

胥偉（1985-），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称返鞍踪|(zhì)化學(xué)及應(yīng)用。E-mail:xuwei1216@163.com