甄俊平，衛(wèi)小春，王晨，李立志，胥毅，楊宇，樊鵬，聶曉

1.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院影像科，太原 030001

2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科，太原030001

3.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院病理科，太原 030001

腫瘤的血管生成是指從已存在的血管形成新生毛細血管的過程[1]，對實體腫瘤的發(fā)生及發(fā)展起關鍵作用。動態(tài)對比增強磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI)提供了探索對比劑滲透到腫瘤間質(zhì)的一種無創(chuàng)手段。研究表明骨肉瘤組織中也存在著組織乏氧現(xiàn)象和血管形成，組織乏氧因子(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)、微血管密度(microvessel density，MVD)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)表達水平與骨肉瘤組織細胞生長、侵襲及轉(zhuǎn)移能力增強相關[1-2]，探討DCE-MRI能否對評價骨肉瘤內(nèi)血管生成情況及乏氧提供可靠、穩(wěn)定、無創(chuàng)的影像方法，進而為臨床的個性化治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集自2011年9月至2014年9月在山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科就診并經(jīng)病理穿刺證實的骨肉瘤患者。檢查前未做過任何放、化療，無肺及遠處轉(zhuǎn)移，所有檢查均征得患者或家屬的知情同意，男18例，女12例。股骨遠端16例，脛骨近端7例，腓骨近端2例，肱骨近端3例，骨盆2例。

1.2 感興趣部位的選擇和標記

選取動態(tài)增強MRI圖像后某一部位感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，將來標記后，CT引導下穿刺活檢，使兩者保持高度一致。

1.3 磁共振平掃及動態(tài)增強掃描

采用GE公司HD3.0 T磁共振掃描儀，使用體部線圈，患者采取仰臥位。平掃選取橫軸位、矢狀位及冠狀位掃描序列包括SE-T1WI、FSET2WI、脂肪抑制序列掃描；冠狀位掃描序列TR為1700 ms，TE為70 ms。經(jīng)肘靜脈快速團注按0.1 mmol/kg體重計算的釓雙胺量，并緊隨20 ml的生理鹽水。增強掃描采用冠狀位，三維快速擾相位梯度回波T1WI多時相成像，共30個時相(600 s)；并最后掃描橫軸位，F(xiàn)SPGRT1WI序列，參數(shù)如下：TR=1700 ms，TE=70 ms，Nex=2，F(xiàn)lip angle=45°。

1.4 動態(tài)增強參數(shù)的獲取和分析

由兩位10年以上工作經(jīng)驗的MRI專業(yè)診斷醫(yī)師診斷和測量，采用GE FuncTool軟件處理圖像，采用雙盲法對動態(tài)增強MRI圖像后處理，獲得感興趣區(qū)時間-信號強度曲線,通過測量得到以下參數(shù)：最大強化率(SImax)、對比劑到達腫瘤組織時間(time at arrival of contrast infl ow，T1 onset)、達峰時間(Tpeak TP)、強化曲線平均斜率(slope)以及最大線性斜率(maximum slope Smax)。

1.5 HIF-1α、CD34和VEGF表達用MaxVision免疫組化二步法測定和MVD計數(shù)

骨肉瘤標本經(jīng)10%的福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，作HE、酶及免疫組化染色。石蠟切片脫蠟至水。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，將切片置于高壓鍋內(nèi)進行抗原修復，3%的H2O2室溫孵育8 min，PBS沖洗，2 min×3次。用HIF-1α多克隆抗體(Thermo公司生產(chǎn))、鼠抗人CD34單克隆抗體(江蘇普羅賽生物技術有限公司)及抗VEGF單克隆抗體(江蘇普羅賽生物技術有限公司)作為一抗進行染色，用DAS顯色[3]。

結果判定：在高倍鏡下(×400)隨機選取4個視野，根據(jù)許良中方法[3]，將染色強度及陽性細胞的按百分率分別計數(shù)，染色強度與背景著色相對比：無染色為0分、棕黃色為1分、中等棕黃色為2分、深棕黃色為3分。陽性細胞的百分率：無陽性細胞為0分、≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分，＞75%為4分。兩項指標的乘積＞3分為免疫反應陽性，兩項計分相乘為最后結果。

低倍鏡下先尋找CD34明顯染色區(qū)(腫瘤血管的熱點區(qū))，后于高倍鏡下計數(shù)染色血管數(shù)量，采用Foote等[4]方法測量單位面積上的血管數(shù)目，取3 個視野內(nèi)的微血管數(shù)目，采用Weidner法進行MVD計數(shù)并計算其平均MVD值。

1.6 統(tǒng)計學方法分析

應用統(tǒng)計分析軟件，版本SPSS 16.0，檢驗水準α=0.05，采用Spearman相關性檢驗。

2 結果

骨肉瘤患者MR平掃圖像見圖1～4；穿刺活檢部位組織學及免疫組化染色結果見圖5～8；增強后興趣區(qū)獲得時間-信號強度曲線見圖9、10；測量動態(tài)增強的諸參數(shù)分別與HIF-1α表達、CD34計數(shù)及VEGF的表達做Spearman相關性檢驗。

HIF-1α、MVD與VEGF 3個指標間是正相關關系,HIF-1α與VEGF有明顯相關性(P＜0.001)。半定量參數(shù)中：T1 onset、TP和HIF-1α、MVD與VEGF表達呈負相關關系，slope、Smax、SImax與HIF-1α、MVD與VEGF 3個指標間呈正相關關系(表1、2)。

3 討論

圖1 、2 矢狀位T1WI顯示脛骨中上段等低混雜信號，可見骨皮質(zhì)破壞和骨膜反應，T2WI可見囊泡狀信號 圖3、4 冠狀位及橫軸位T2壓脂序列，可見骺板有局部受侵，周圍可見軟組織腫塊圖5 大體標本瘤細胞異型性明顯，可見多核瘤巨細胞，病理核分裂易見，大量瘤性成骨 圖6 免疫組化結果 CD34（血管+)，穿刺病理標本的MVD 圖7、8 分別為穿刺病理標本的血管內(nèi)皮生長因子及乏氧誘導因子-1的表達 圖9 感興趣的選擇，興趣區(qū)1為骨肉瘤組織，興趣區(qū)2為正常骨組織 圖10 骨肉瘤時間-信號強度曲線和斜率、強度圖Fig.1 ,2 The sagittal T1WI shows low-mixed signals on the upper tibia.Visible cortical bone destruction and periosteal reaction also can be found.T2WI shows visible vesicle-like signal.Fig.3,4 Coronal and axial T2 fat pressure sequence,the epiphyseal plate has been localy involved,the tumor has been surrounded by the soft tissue.Fig.5 The specimens.The tumor cell atypia,multinucleated giant cell tumor,and the pathological mitotic,is easy to see.Also,a lot of neoplastic bone formation.Fig.6 Immunohistochemistry CD34(vascular +)and MVD of biopsy specimen can be seen as well.Fig.7 Biopsy specimens of vascular endothelial growth factor.Fig.8 Hypoxia inducible factor-1 expression.Fig.9 Shows interesting options,interest area 1 is the osteosarcoma tissue,interest area 2 is the normal bone tissue.Fig.10 Time-signal intensity curve.

表1 MR動態(tài)參數(shù)與HIF-1α、MVD及VEGF表達的相關性Tab.1 The correlations beween MR dynamic parameters and HIF-1α,MVD and VEGF expression

表2 HIF-1α、MVD與VEGF三者表達的相關性Tab.2 Correlations between HIF-1α,MVD and VEGF expression

3.1 腫瘤動態(tài)增強MRI

MRI多方位、多序列成像，高分辨成像能對腫瘤，特別是骨肉瘤的脈管系統(tǒng)提供更好的形態(tài)學的顯示，隨著時間分辨力的提高，可以實現(xiàn)對腫瘤增強掃描的動態(tài)現(xiàn)象，提供腫瘤微循環(huán)的灌注信息，為個性化治療提供科學指導和依據(jù)。Mayr等[5]通過研究發(fā)現(xiàn)：應用動態(tài)增強磁共振成像來判斷宮頸癌的放射敏感性及使用逐象素的動態(tài)對比度增強分析長期腫瘤控制的預后，確定腫瘤微循環(huán)的異質(zhì)性。該研究對16例晚期宮頸癌檢查與動態(tài)對比增強磁共振成像在放射治療的過程中進行逐個像素的統(tǒng)計后比率，以在腫瘤區(qū)域掃相對信號強度(RSI)值的分析來生成的動態(tài)增強圖案的像素的RSI分布。初步研究結果表明，在腫瘤內(nèi)差的血管區(qū)域，動態(tài)增強掃描的定量可能在預測長期腫瘤控制和治療，對宮頸癌治療有指導意義。Gong等[6]研究7例宮頸癌36次MRI檢查，前瞻性研究調(diào)查了放射治療時宮頸癌的MRI動態(tài)增強與宮頸癌改變之間的關系，并在整個放療監(jiān)測腫瘤消退率。結果發(fā)現(xiàn)，峰和平均增強參數(shù)放射治療前介于3.0至13.3和1.9至12.2，經(jīng)2周放療，峰和增強后意味著增強介于7.5至13.0和6.3至10.6。在峰值和平均動態(tài)掃描之間腫瘤增強的變化范圍分別從－2.0至8.4和－4.5至8.5。腫瘤體積隨時間(P＜0.01)呈指數(shù)衰減。腫瘤消退率從2.0%至每天15.2%，并且與兩個峰的變化相關，且平均腫瘤增強(P＜0.01)?？梢缘贸鼋Y論，MR監(jiān)測第2周放療的動態(tài)增強可能提供早期的腫瘤消退率預測，因此DCE-MRI是宮頸癌治療方案的有效檢測手段。Hye Suk Hong[7]指出最大上升斜率MSI與直腸癌的N分期表現(xiàn)出顯著相關性，能夠提供有用的預后信息(化療之后又一種療效確切的治療方案)。

3.2 實體腫瘤乏氧及血管形成相關性

腫瘤血管生成的重要刺激是缺氧，缺氧誘導基因轉(zhuǎn)錄以此改變細胞代謝，并且促進血管生成。組織乏氧誘導HIF-1形成，HIF-1是由α亞基和β亞基(HIF-1α和HIF-1β)的結合形成的異二聚體，在正常氧供條件下，HIF-1β經(jīng)常在哺乳動物細胞中表達，但是HIF-1α仍未被發(fā)現(xiàn)。而在乏氧時，HIF-1α可以被表達。而且HIF-1α陽性細胞在腫瘤壞死周圍和微血管密度較高的區(qū)域非常密集，以腫瘤浸潤邊緣最多。研究表明乏氧導致的VEGF高表達是由HIF-1α誘導的，高的VEGF表達使組織內(nèi)微血管密度增加，導致腫瘤生長以及與局部轉(zhuǎn)移直接相關，而與生存率沒有正相關性，乏氧改變了細胞代謝并且促進細胞生長、結構改變、提高血管滲透性，使癌細胞易于進入血循環(huán)，多種機制可能導致了其發(fā)生發(fā)展，包括無抑制的的生長、腫瘤細胞增加的氧耗、淋巴引流不暢導致間質(zhì)高壓、血管破壞和低PH以及瘤內(nèi)由不成熟血管引流的富氧血流。此外，腫瘤血管生成未必等同于腫瘤血供，不成熟新生血管的基底膜允許血漿和蛋白外滲透，進一步增加間質(zhì)瘤內(nèi)壓力的外滲，血管持續(xù)崩潰，以及營養(yǎng)輸送的缺乏[7-14]。

3.3 骨肉瘤的DCE-MRI與乏氧及血管生成

骨肉瘤主要病理改變主要有：瘤骨形成、骨膜反應和軟組織腫塊，其中肉瘤部分對血管依賴性強[15]。將DCE-MRI的手段運用到骨和軟組織腫瘤的術后隨訪中，對于區(qū)分腫瘤術后復發(fā)、新發(fā)腫瘤結節(jié)、鑒別炎癥及反應性改變將起到不可替代的作用。對術后及放化療后復發(fā)的腫瘤，該手段能夠較為迅速且準確地檢查出來[13]。近年來，相關的研究成果表明：MVD與腫瘤的惡性程度、與周圍組織浸潤程度、術后復發(fā)以及預后關系密切。MVD已成為判斷腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移和療效的重要指標。而目前抗血管生成治療也己成為繼手術切除、放射治療的又一新的治療方法。如果化療能有效抑制骨肉瘤生長，細胞毒性藥物必須達到對所有的腫瘤細胞作用的有效劑量。雖然許多臨床試驗包括在血液或腦脊液這些藥物的藥代動力學研究中，至今仍沒有確定的化療藥是否到達實體瘤的所有區(qū)域。Reddick等[16]討論了使用DCEMRI來評估骨肉瘤的微循環(huán)和間質(zhì)。DCE-MRI提供了探索對比劑泄漏到腫瘤間質(zhì)的手段。在對眾多骨肉瘤的臨床觀察中，對比增強方法及增強后相關參數(shù)的測量，可以測量和預測骨肉瘤對術前化療的反應敏感性。

本研究結果表明,MR動態(tài)增強掃描可反映骨肉瘤腫瘤組織乏氧與血管生成情況。由于骨肉瘤具有腫瘤異質(zhì)性特點，本研究并未對比研究實體瘤外周區(qū)域及中心區(qū)域DCE-MRI半定量參數(shù)及HIF-1α、MVD及VEGF表達的差異。

[References]

[1]Graham CH,Forsdike J,Fitzgerald CJ,et al.Hypoxia-mediated stimulation of carcinoma cell invasiveness via upregulation of urokinase receptor expression.Int J Cancer,1999,80(4):617-623.

[2]Stadler P,Becker A,Feldmann HJ,et al.Influence of the Hypoxic subvolume on the survival of patients with head and neck cancer.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1999,44(4):749-754.

[3]Liang JH,Li JG.Dynamic enhanced MRI for nasopharyngeal carcinoma tissue hypoxia and angiogenesis detection research.The Practical Journal of Cancer,2010,25(4):350-353.梁璟慧,李金高.動態(tài)增強MRI對鼻咽癌組織內(nèi)乏氧和血管生成檢測的研究.實用癌癥雜志,2010,25(4):350-353.

[4]Foote RL,Weidner N,Harris J,et al.Evaluation of tumor angiogenesis measured with microvessel density(MVD)as a Prognostic Indicator in nasopharyngealcarcinoma results of RTOG 9505.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,61(3):745-753.

[5]Mayr NA,Yuh WT,Arnholt JC,et al.Pixel analysis of MR Perfusion imaging in predictin gradiation therapy outcome in Cervical cancer.Magn Reson Imaging,2000,12(6):1027-1033.

[6]Gong QY,Brunt JN,Romaniuk CS,et al.Contrast enhanced Dynamic MRI of cervical carcinoma during radiotherpy:Early prediction of tumour regression rate.Br J Radiol,1999,72(864):1177-1184.

[7]Hong HS,Kim SH,Park HJ,et al.Correlations of dynamic contrast.Enhanced magnetic resonance imaging with morphologic,angiogenic,and molecular prognostic factors in rectal cancer.Yonsei medical journal,2013,54(1):123-130.

[8]Semenza GL.Intra tumo ralhypoxia,radiation resistance,and HIF-1.Cancer Cell,2004,5(5):405-406.

[9]Quintero M,Mackenzie N,Brennan PA.Hypoxia-inducible factor1(HIF-1)in cancer.Eur J Surg Oncol,2004,30(5):465-468.

[10]Moeller BJ,Cao Y,Li CY,et al.Radiation activates HIF-1 To regulate vascular radio sensitivity intumors:role of reoxygenation,free radicals,and stress granules.Cancer Cell,2004,5(5):429-441.

[11]Duffy JP,Eibl G,Reber HA,et al.Influence of hypoxia and neoangiogenesis on the growth of pancreatic cancer.Mol Cancer,2003,22(2):12.

[12]Li M,Jin Z,Li GJ,et al.Correlation between angiogenesis and multiparameters of Dynamic contrast-enhanced for assessments of benign and malignant breast lesions.Chin J Magn Reson Imaging,2010,1(1):36-42.李敏,金真,李功杰,等.乳腺動態(tài)增強MRI參數(shù)與腫瘤血管的相關性及其鑒別診斷價值.磁共振成像,2010,1(1):36-42.

[13]Padhani AR,Hayes C,Assersohn L,et a1.Prediction of clinic pathologic response of breast cancer to primary chemotherapy at contrast-enhanced MR imaging：initial clinical results.Radiology—Radiological Society of North America,2006,239(2):361-374.

[14]Lu RZ,Zhang JC,Yang ZH,et al.The value of dynamic contrastenhanced MRI in assessing the early-term effectiveness of highintensity focused ultrasound ablation of hysteromyoma.Chin J Magn Reson Imaging,2013,4(4):39-43.盧瑞沾,張俊成,楊振華,等.DCE-MRI對評價高強度聚焦超聲刀治療子宮肌瘤早期療效的價值.磁共振成像,2013,4(4):271-275.

[15]Chen HS,Han Y,Geng Q,et al.The differential diagnosis between benign and malignant bone tumors.Chin J Magn Reson Imaging,2014,5(4):291-293.陳海松,韓燕,耿青,等.良惡性骨腫瘤的MRI鑒別診斷.磁共振成像,2014,5(4):291-293.

[16]Reddick WE,Taylor JS,Fletcher BD.Dynamic MR imaging(DCEMRI)of microcirculation in bone sarcoma.J Magn Reson Imaging,1999,10(3):277-285.