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        hTERC基因檢測對宮頸癌的診斷價值及FISH技術(shù)檢測優(yōu)勢

        2015-12-09 16:35:21綜述曹志星審校
        醫(yī)學(xué)綜述 2015年19期
        關(guān)鍵詞:檢測

        呂 威(綜述),曹志星(審校)

        (珠海市第二人民醫(yī)院病理科,廣東珠海519020)

        在女性生殖道腫瘤中,宮頸癌發(fā)病率位居首位[1]。在我國,其病死率僅次于卵巢癌,成為危害女性健康的首要疾病之一[2]。據(jù)德國、美國等研究報道,在過去的20年里,宮頸癌發(fā)病越來越年輕化;此外,我國吉林省的一項調(diào)查顯示,近年來,年齡<35歲的年輕宮頸癌患者占宮頸癌總患者的比例顯著增加[3]??梢?,宮頸癌發(fā)病呈年輕化趨勢,并具有全球普遍性。值得慶幸的是,宮頸癌的癌前病變期較長,為 8~10年[4-5]。因此,對宮頸癌癌前病變進行及時有效的篩查是降低宮頸癌發(fā)病率和病死率的關(guān)鍵。目前,利用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybrid-ization,F(xiàn)ISH)對宮頸病變細胞中人類染色體端粒酶(human telomerase RNA component,hTERC)基因的擴增狀況進行檢測,正在我國臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸開展,現(xiàn)就其進展狀況及優(yōu)勢予以綜述。

        1 宮頸病變

        宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)被認為是宮頸浸潤癌的前期病變,它的發(fā)生與衛(wèi)生習(xí)慣及性生活混亂等因素密切相關(guān),而病毒感染是其最根本的原因,如人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染[6]。在絕大多數(shù)病例中,CIN并不好發(fā)于宮頸正常鱗狀上皮,反而多累及子宮頸鱗、柱交界處,即移行帶或交界帶[7]。傳統(tǒng)上,將CIN分為3級:CINⅠ級相當于輕度非典型增生(累及上皮層下部1/3),CINⅡ級相當于中度非典型增生(累及上皮層下部2/3),而CINⅢ級相當于重度非典型增生和原位癌(累及上皮層2/3以上至全層)[8]。目前,又提出了一種新的宮頸病變分類系統(tǒng),稱為Bethesda分類,該系統(tǒng)最初用于宮頸細胞學(xué)診斷,即鱗狀上皮內(nèi)病變;按Bethesda分類可以分為低級別上皮內(nèi)病變和高級別上皮內(nèi)病變,低級別上皮內(nèi)病變相當于CINⅠ級(以及某些HPV引起的不能診斷為CIN的病變),而高級別上皮內(nèi)病變則相當于CINⅡ級和CINⅢ級[9-11]。腫瘤細胞一旦突破基膜浸潤至間質(zhì),則表示宮頸上皮內(nèi)病變已進展至宮頸浸潤性癌。一般而言,處于CINⅠ級、CINⅡ級,甚至部分CINⅢ級的宮頸病變是可逆的,理論上完全可以通過篩查的方式及時發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)病變,從而進行合理治療,降低其對女性的危害[6]。20世紀90年代,正是由于進行了大規(guī)模的宮頸癌前病變篩查,才使我國宮頸癌的病死率與70年代相比,降低了63.64%[12]??梢姡侠砗Y查對于宮頸病變的防范尤為重要。

        2 hTERC基因

        2.1 hTERC 基因與端粒酶 正常體細胞分裂一定次數(shù)后就進入老化階段,失去復(fù)制能力,稱為復(fù)制性老化。細胞的復(fù)制次數(shù)是由一種特殊的DNA重復(fù)序列控制的,它位于染色體末端,稱為端粒。細胞復(fù)制一次,端粒就縮短一點,當細胞復(fù)制一定次數(shù)和端粒縮短到一定程度后,就會被DNA修復(fù)機制(如“雙鏈DNA斷裂”)所識別,從而激活p53或視網(wǎng)膜母細胞瘤基因產(chǎn)物依賴的細胞周期G1期停滯或凋亡。而在生殖細胞和干細胞,由于端粒酶的存在可使縮短的端粒得以恢復(fù),因此生殖細胞和干細胞具有十分強大的自我復(fù)制能力。腫瘤細胞,尤其在惡性腫瘤中,幾乎能無限復(fù)制,這與端粒酶表達增加有關(guān)。實驗表明,85%~95%的人類惡性腫瘤細胞均有一定程度的端粒酶活性,而人體正常細胞幾乎沒有此活性[13](145-146)。端粒酶是一種具有逆轉(zhuǎn)錄活性的、依賴RNA的DNA聚合酶,將自身RNA作為模板,通過向端粒末端添加序列(TTAGGG)的方式維持端粒的長度,從而使細胞能夠持續(xù)復(fù)制,得以永生。端粒酶主要包含人端粒酶RNA、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和人端粒酶相關(guān)蛋白1三部分,這些結(jié)構(gòu)的共同存在、協(xié)同作用使端粒酶能發(fā)揮永生化細胞的功能。其中,端粒酶的主體結(jié)構(gòu)是hTERC,它的編碼基因位于3號染色體長臂,此基因的擴增使宮頸細胞極易發(fā)生非典型性發(fā)育異常,進而轉(zhuǎn)變?yōu)閷m頸癌,這一觀點已在2005年被美國國家衛(wèi)生研究院的一項關(guān)于宮頸癌的研究所證實[14-15]。可見,hTERC基因在調(diào)控端粒酶活性及促使宮頸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用。

        2.2 hTERC基因與HPV HPV是一種DNA病毒,它的基因組是雙鏈的,呈閉合環(huán)狀,其基因組大致包含3個基因區(qū):上游調(diào)控區(qū)、早期編碼蛋白區(qū)(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和晚期編碼蛋白區(qū)(L1、L2、E4、E5)。根據(jù)HPV感染的不同后果,可將其分為低危型和高危型,低危型HPV感染可在數(shù)月至數(shù)年內(nèi)被清除,并不引起宮頸病變,甚至沒有任何臨床癥狀,只是“一過性”的;而高危型HPV的持續(xù)性、慢性感染則與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16]。低危型HPV可引起生殖道乳頭狀瘤和癌前病變,其亞型主要包括HPV-6和HPV-11,且病毒的基因組尚未整合到宿主細胞DNA中;而在宮頸癌,高危型HPV-16或HPV-18的基因組已與宿主細胞的DNA進行整合,提示病毒DNA的整合對于加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展非常重要,不僅如此,整合的高危型病毒基因組在同一腫瘤的所有癌細胞中均在同一位置,提示整合方式是克隆性的;進一步分析發(fā)現(xiàn),其整合位點總是在E1/E2開放閱讀框架內(nèi),E2區(qū)的中斷使HPV-16或HPV-18的E6和E7蛋白過度表達,進而擴增的E6和E7蛋白可與p53蛋白結(jié)合并導(dǎo)致后者降解,從而激活端粒酶,抑制細胞凋亡;或干擾p53基因轉(zhuǎn)錄,同時對hTERC基因及端粒酶的激活產(chǎn)生協(xié)同作用,促進癌癥發(fā)生[13(153),17]。Hopman等[18]的實驗結(jié)論便充分印證了上述理論,他們用FISH方法檢測宮頸病變中hTERC基因擴增和HPV整合情況的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)hTERC基因隨著病變的加重,擴增率逐漸提高,且在hTERC基因擴增的病例中,HPV整合突出,提示hTERC基因擴增和HPV整合呈正相關(guān),進而推測hTERC基因的擴增及端粒酶的激活可能與HPV致癌機制密切相關(guān)。

        3 FISH

        FISH的理論基礎(chǔ)為核酸雜交,狹義的FISH指DNA-DNA雜交,廣義的FISH指DNA-DNA和DNA-RNA雜交。無論狹義還是廣義,均利用被檢樣本細胞中核酸序列與探針的互補性進行雜交,最終在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光信號表達以及表達數(shù)值的多少而得出結(jié)果。FISH包括直接法和間接法,直接法以熒光素直接標記已知探針,經(jīng)過標本與探針的共同變性、雜交及漂洗等步驟后,可直接在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果;而間接法在標本與探針經(jīng)歷變性、雜交、漂洗之后,將熒光標志物同時與已知探針及其特異性抗體結(jié)合,進而放大待檢信號;目前FISH已從單色發(fā)展至雙色甚至多色,這使觀察者能同時檢測多個核酸序列有無異常[19]。FISH的實驗材料可以是細胞涂片、冰凍組織切片或常規(guī)石蠟包埋組織切片等[13](513)。由于FISH操作重復(fù)性好,具有很高的特異性和敏感性,目前已越來越多地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué),如膀胱癌、乳腺浸潤癌等的基因檢測中。

        4 FISH檢測hTERC基因在宮頸病變中的應(yīng)用與優(yōu)勢

        研究表明,采用FISH檢測宮頸細胞hTERC基因的擴增率,可作為CIN由低級別進展到高級別的指標,還可以提高宮頸癌前病變的篩查率,是一種損傷較小的、比較可靠的檢測手段[20-23]。此外,任飛飛等[24]將直接涂片法、液基、石蠟切片等不同制片方法進行對比,發(fā)現(xiàn)在檢測hTERC基因的宮頸癌篩查中,宮頸液基薄層細胞學(xué)檢查制片法明顯優(yōu)于其他方法;但hTERC基因雜交成功率以石蠟包埋組織切片最高,為85.7%,同時,其熒光信號滿意率也最高,且在指導(dǎo)宮頸病變及宮頸癌的治療中,石蠟包埋組織切片法的染色體破壞最小,實際意義更大。目前,除FISH檢測宮頸病變中hTERC基因的擴增情況外,宮頸病變篩查的主要方式還包括肉眼觀察、宮頸細胞學(xué)檢測、HPV檢測及陰道鏡檢查等。其中,肉眼觀察范圍較局限,易漏診頸管內(nèi)病變,同時檢查記錄難以保存,質(zhì)控困難;細胞學(xué)檢查是一種形態(tài)學(xué)檢查,受觀察者專業(yè)知識、經(jīng)驗等主觀因素的影響,有時難以作出客觀、準確的診斷[25];針對HPV感染的檢測雖靈敏度高達84%~100%,但其特異度只有64%~95%,而且也只能檢測出檢查當時的HPV狀態(tài),其實大多數(shù)婦女,特別是性生活活躍的年輕女性,HPV感染只是暫時的,在一段時間內(nèi)會自然轉(zhuǎn)陰,并不會引發(fā)宮頸癌,這使HPV陽性的預(yù)測意義較低[26];而陰道鏡檢查雖然無創(chuàng)、操作方便、可重復(fù),但有研究表明,其檢出高級別上皮內(nèi)病變的靈敏度和特異度分別為19.1%和91.6%,檢出低級別上皮內(nèi)病變的靈敏度和特異度分別為82.1%和58.7%,提示陰道鏡不適合作為篩查使用[27]。綜上所述,鑒于宮頸癌篩查的關(guān)鍵性和重要性,急待尋找其他檢測方法以彌補上述方法的不足。應(yīng)用FISH檢測hTERC基因的優(yōu)勢包括:①重復(fù)性好,定位準確;②敏感性與特異性高;③結(jié)果直接清晰,易于判讀。

        5 小結(jié)

        研究顯示,hTERC基因擴增陽性的患者治療后病變復(fù)發(fā)率較陰性的患者高[28-29],由此可知,應(yīng)用FISH檢測hTERC基因的擴增情況,不僅可用于宮頸病變篩查,還有可能作為預(yù)后指標。另外,將hTERC基因在宮頸病變及病變旁組織中的表達情況進行分析,從而試圖在宮頸病變旁組織中找到一個合適的距離作為安全手術(shù)范圍,最大可能降低復(fù)發(fā)率。可見,F(xiàn)ISH檢測hTERC基因的應(yīng)用將在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以其突出的優(yōu)勢發(fā)揮更大的作用。

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