于巧芝，賴鐘雄

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002）

藍(lán)莓組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

于巧芝，賴鐘雄*

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002）

綜述了目前國(guó)內(nèi)藍(lán)莓組織培養(yǎng)技術(shù)的研究狀況，介紹了藍(lán)莓組織培養(yǎng)過程中不同外植體無菌體系的建立、外植體培養(yǎng)、試管苗生根培養(yǎng)等方面的技術(shù)，并對(duì)藍(lán)莓組織培養(yǎng)中的問題進(jìn)行了分析，最后對(duì)組織培養(yǎng)技術(shù)在藍(lán)莓栽培中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

藍(lán)莓；組織培養(yǎng)；應(yīng)用

藍(lán)莓（blueberry）又稱越橘、藍(lán)漿果，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vacciniodeae）植物，起源于北美，為多年生灌木小漿果果樹。因其含有大量的花青素，是近年來研究的熱門水果[1-2]。藍(lán)莓果實(shí)中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有防止腦神經(jīng)老化、強(qiáng)心、抗癌、軟化血管、增強(qiáng)人機(jī)體免疫等功能，被國(guó)際糧農(nóng)組織認(rèn)定為五大健康食品之一。目前我國(guó)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的藍(lán)莓制品種類不斷增加，銷量也呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。傳統(tǒng)的藍(lán)莓產(chǎn)區(qū)——北美產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)量已遠(yuǎn)不能滿足本地和世界市場(chǎng)的需求，因此世界上許多國(guó)家已先后引種。近年來，我國(guó)藍(lán)莓的種植面積日益擴(kuò)大[3]，但常規(guī)栽培方式培養(yǎng)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)效率較低，而運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)可提高藍(lán)莓的生產(chǎn)效率，縮短培養(yǎng)周期，培育無病毒植株?，F(xiàn)對(duì)近幾年來國(guó)內(nèi)對(duì)藍(lán)莓組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行較系統(tǒng)性的綜述，為藍(lán)莓組織培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步探究提供參考。

1 外植體的采集和處理

1.1 取材

藍(lán)莓的各個(gè)器官都可用作組織培養(yǎng)中的外植體材料，如種子、休眠枝條、成齡的莖段或莖尖，以及一些去除葉柄和葉端邊緣的葉片。在試驗(yàn)過程中，通常采用的材料以成年植株上取得的莖段和莖尖組織為主，其增殖率相對(duì)較高，易成活，操作簡(jiǎn)便。也有試驗(yàn)證實(shí)帶葉柄的葉片出芽率最高。

另外，不同的取材時(shí)間對(duì)藍(lán)莓的增殖也有一定影響。王連潤(rùn)等[4]在試驗(yàn)中，選取藍(lán)莓當(dāng)年10月生、生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的枝條，剪成3～4 cm莖段進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明生長(zhǎng)勢(shì)健壯、帶隱芽的莖段污染率較低。Sidorocich等通過對(duì)一年當(dāng)中不同時(shí)期的藍(lán)莓試材進(jìn)行組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，4月份為最佳的取材時(shí)

期，此時(shí)的莖段產(chǎn)生愈傷組織相對(duì)較少，生長(zhǎng)相對(duì)較快，芽更易分化且褐變現(xiàn)象明顯減少[5]。

1.2 消毒

在對(duì)外植體進(jìn)行消毒時(shí)，不同種類的外植體所使用的消毒方法不同，消毒劑的種類以及消毒時(shí)間和消毒劑所使用的含量也會(huì)影響消毒效果，從而影響外植體的污染率。在藍(lán)莓組織培養(yǎng)過程中用到的消毒藥劑通常有：含2%次氯酸鈉溶液、0.1%升汞溶液和12%H2O2溶液等，所使用的量和消毒時(shí)間也有一定的差異。根據(jù)已有報(bào)道，外植體消毒方法為：滅菌之前用洗衣粉浸泡外植體，并用流水沖洗數(shù)分鐘，然后用乙醇對(duì)材料進(jìn)行預(yù)滅菌，使用濃度一般為70%～75%，滅菌時(shí)間為30～600 s；升汞的使用濃度0.1%，滅菌時(shí)間為5～10 min，當(dāng)滅菌時(shí)間超過10 min時(shí)，會(huì)對(duì)藍(lán)莓外植體產(chǎn)生毒害作用，造成外植體死亡[6-17]。陶興魁等[18]認(rèn)為用2%的NaClO將藍(lán)莓外植體浸泡10 min，有利于降低外植體的污染率。12%雙氧水處理10 min和升汞雙次滅菌法常用于藍(lán)莓葉子滅菌。王連潤(rùn)等[14]研究認(rèn)為，用帶隱芽的健壯材料建立無菌苗，污染率最高不超過8%，成苗率高，90%以上的芽能抽梢形成正常的綠苗。

2 外植體的培養(yǎng)

2.1 基本培養(yǎng)基的選擇

已有研究報(bào)道，藍(lán)莓莖段培養(yǎng)所用過的基本培養(yǎng)基有MS、1/2MS、White、WPM、改良WPM、knops培養(yǎng)基和B5等幾種。1983年Wolfe比較了7種培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)WPM（Woody Plant Medium）培養(yǎng)基效果最好[19]。在制備培養(yǎng)基時(shí)，用Ca（NO3）2·4H2O 684 mg/L、KNO3190 mg/L、C10H13FeN2NaO873.4 mg/L和鹽酸硫胺素0.1 mg/L，取代原WPM培養(yǎng)基中的K2SO4、CaCl2、FeSO4和Na2EDTA，稱為改良型的WPM。劉慶忠[8]、郝明明等[20]在用改良WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)藍(lán)莓時(shí)，獲得良好效果。但由于藍(lán)莓品種的不同，所需要的營(yíng)養(yǎng)也會(huì)有相應(yīng)的差異，所以在培養(yǎng)基選擇的過程中應(yīng)根據(jù)需要進(jìn)行選擇，不能照搬他人的研究結(jié)果。馬艷麗[13]研究得出，對(duì)于高叢藍(lán)莓，用改良MS培養(yǎng)，最高再生率可達(dá)75%；廉家盛等[21]研究得出B5培養(yǎng)基最適合“美登”藍(lán)莓不定芽增殖生長(zhǎng)，而對(duì)兔眼藍(lán)莓用改良knops培養(yǎng)最合適，可達(dá)到將近85%的增殖率。目前大部分研究者都使用改良的WPM作為藍(lán)莓組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

2.2 激素種類和濃度

基本培養(yǎng)基只能維持外植體基本的生存，如果想要獲得更加優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)效果，需要按照需求添加不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來促使其分化成健壯的試管苗。而決定植物形態(tài)發(fā)生啟動(dòng)和分化方向重要的2個(gè)因素是植物激素的種類和濃度的配比。對(duì)于玉米素ZT的濃度，聶飛等[11]的研究表明，選用ZT 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L均能誘導(dǎo)叢生枝，幾種濃度條件下藍(lán)莓的繁殖系數(shù)相差不大，ZT 0.5 mg/L時(shí)，出現(xiàn)4～6個(gè)新生枝，節(jié)間長(zhǎng)0.6～0.8 cm，苗高達(dá)到0.6～2.0 cm，4～8枚葉片，無枯梢現(xiàn)象，但新生枝數(shù)目?jī)H為添加ZT 1.0 mg/L時(shí)的一半，20 d后將ZT恢復(fù)到1.0 mg/L時(shí)，增殖新生枝8～15個(gè)，因此，2種濃度可交替使用。在改良的WPM培養(yǎng)基上經(jīng)4周培養(yǎng)，葉片與葉柄交界處4～6個(gè)小枝被誘導(dǎo)出，轉(zhuǎn)接到含ZT 0.5和1.0 mg/L的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，新生枝增殖倍數(shù)將會(huì)保持在6倍以上[20]。在以莖尖為外植體的研究過程中，董朝莉[10]采用改良WPM為基本培養(yǎng)基，研究越橘的組培育苗技術(shù)，結(jié)果表明，以兔眼越橘當(dāng)年生綠枝莖段為外植體可有效獲得無菌苗；越橘莖段的離體增殖率受到培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的調(diào)控，ZT 1～2 mg/L和2ip 10～20 mg/L的效果較好。寧志怨等[22]在越橘叢生芽的誘導(dǎo)上利用改良MS+2 mg/L ZT+0.2 mg/L NAA的增殖培養(yǎng)基，經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)后越橘的增殖系數(shù)可達(dá)30～50倍。劉樹英[17]對(duì)Gardenblue等7個(gè)兔眼越橘的研究表明，莖段芽的萌發(fā)生長(zhǎng)適宜的激素配比為15 mg/L 2ip+0.02 mg/L NAA，并且2ip的濃度為15 mg/L、ZT的濃度為3 mg/L時(shí)對(duì)芽的萌發(fā)有利。在對(duì)藍(lán)莓外植體進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，選擇合適的培養(yǎng)基種類以及適當(dāng)?shù)募に嘏浔?，?duì)藍(lán)莓的增殖生長(zhǎng)有明顯影響。

2.3 培養(yǎng)條件

一般的培養(yǎng)條件為在基本培養(yǎng)基中添加蔗糖20 mg/L、瓊脂6～8 g/L，用1 mol的NaOH調(diào)節(jié)pH至4.8左右；培養(yǎng)基在121℃、131 kPa的條件下滅菌不超過20 min。接種后培養(yǎng)溫度為25℃左右，光強(qiáng)度為2 500 lx，光周期為16 h黑暗、8 h光照的條件。劉樹英等[17]研究發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度為3 000和4 000 lx為芽增殖的最適光強(qiáng)，芽增殖數(shù)量多且增殖系數(shù)分別達(dá)4.0和4.5；還指出pH為5.4時(shí)培養(yǎng)生長(zhǎng)長(zhǎng)度達(dá)7～9 cm。研究表明，在組織培養(yǎng)前進(jìn)行暗培養(yǎng)可增加越橘不定芽的誘導(dǎo)率。Rida[23]以越橘葉片進(jìn)行培養(yǎng)

前，以黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2周，大大提高了不定芽的誘導(dǎo)率。pH低于5.2或高于5.3均不利于叢生芽的誘導(dǎo)，表現(xiàn)低分化率，且死亡數(shù)目很多，適當(dāng)?shù)膒H對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)非常重要[19]。

3 外植體的生根培養(yǎng)

3.1 試管苗瓶?jī)?nèi)生根

藍(lán)莓屬于越橘屬植物，因其沒有側(cè)根，一般根系較弱。大量試驗(yàn)表明，藍(lán)莓在組培苗瓶?jī)?nèi)生根速度慢，生根率低，并且生長(zhǎng)勢(shì)弱，根較細(xì)，所以藍(lán)莓不適宜在試管內(nèi)生根。王連潤(rùn)等[14]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓在改良的1/2WPM基本培養(yǎng)基添加0.3 mg/L IBA的生根培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)20 d后，生根率不到5%，培養(yǎng)60 d后生根率才達(dá)70%～90%。國(guó)內(nèi)大量研究表明，以1/2 WPM培養(yǎng)基對(duì)藍(lán)莓生根培養(yǎng)效果相對(duì)較好。王平紅等[24]以改良1/2 WPM作為基本培養(yǎng)基添加0.6 mg/L IBA，試管苗在45 d左右開始生根，生根率可達(dá)75.3%。不同品種的藍(lán)莓瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)有一定差異。孫書偉以1/2 WPM為基本培養(yǎng)基，對(duì)藍(lán)豐、伯克利組培苗的生根技術(shù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明藍(lán)豐在0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基上，生根數(shù)量和生根率最好，28 d的生根率達(dá)100%，而伯克利在添加0.05 mg/L IBA的培養(yǎng)基上，32 d時(shí)生根率達(dá)100%，取得了理想的效果[25]。2011年，關(guān)麗霞建立了藍(lán)莓組培苗瓶?jī)?nèi)淺層液體生根技術(shù)體系，使得生根率達(dá)到了96.5%以上[26]。

3.2 試管苗瓶外生根

由于藍(lán)莓在試管內(nèi)生根的效果不佳，無法滿足生產(chǎn)需求，所以在對(duì)藍(lán)莓微體繁殖研究時(shí)，一般均在試管外生根或在彌霧條件下扦插試管幼枝生根[27]。在扦插生根中，一般以苔蘚作為扦插基質(zhì)，生根率較高。苔蘚用500倍多菌靈溶液浸泡撈出后稍瀝干水分，鋪到事先準(zhǔn)備好的苗床上，壓平壓實(shí)，苔蘚厚度5～7 cm。將復(fù)壯的組培苗剪成2 cm左右，速蘸100 mg/LIBA溶液后，扦插于經(jīng)滅菌處理的苔蘚基質(zhì)苗床上，空氣濕度保持95%以上，2周后相對(duì)濕度85%～90%，溫度保持在20～28℃。40 d生根成活率可達(dá)70%～80%；90 d后，生出大量不定根，長(zhǎng)度可達(dá)30 cm[28]。在對(duì)高叢越橘的研究中，在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，可將生根的試管苗或未生根的新梢移栽進(jìn)行栽培，移栽基質(zhì)為1∶1的草炭土與河沙。移栽后將小拱棚密閉，可達(dá)到保濕作用，封閉40 d后，越橘苗達(dá)到并恢復(fù)長(zhǎng)勢(shì)較好狀態(tài)后慢慢通風(fēng)，1個(gè)月澆2次0.5%的FeSO4溶液，成活率可達(dá)50%以上[18]?；|(zhì)的差異對(duì)扦插苗瓶外生根率影響較大，研究表明，苔蘚是其扦插生根的最優(yōu)基質(zhì)；NAA和IBA各1 000 mg/kg按1∶1混和處理時(shí)獲得最佳生根率為85%，根系總長(zhǎng)度接近700 cm。根據(jù)不同品種的藍(lán)莓選擇適宜的生根基質(zhì)，可提高試管苗的生根率[29]。

4 存在的問題及展望

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)藍(lán)莓生產(chǎn)的研究已大大加快。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的越橘屬植物已有90多種，運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)我國(guó)藍(lán)莓種質(zhì)資源的保存和開發(fā)利用有著重要意義。與常規(guī)育苗方法相比，組織培養(yǎng)育苗可大大縮短培養(yǎng)周期，在操作上更加簡(jiǎn)便，并能培育出健壯整齊的組培苗。而且對(duì)藍(lán)莓組培苗進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，可獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的種苗，并且不受季節(jié)地域的限制。通過建立起一套完整的組織培養(yǎng)體系，可為藍(lán)莓的工廠化育苗提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)，為國(guó)內(nèi)的藍(lán)莓市場(chǎng)提供新的技術(shù)指導(dǎo)。開展藍(lán)莓組織培養(yǎng)研究，為保存不同基因型藍(lán)莓的優(yōu)良性狀提供了技術(shù)支撐，有利于優(yōu)良種質(zhì)資源的保存，為優(yōu)化的再生體系建立提供了保障。雖然近年來藍(lán)莓組織培養(yǎng)技術(shù)取得了顯著進(jìn)展，但在實(shí)際生產(chǎn)操作中仍舊存在一些問題：①在組織培養(yǎng)過程中，污染率仍然較高，分化率、成活率、生根率仍然有待提高；②不同品種藍(lán)莓的培養(yǎng)條件缺少一套合理的系統(tǒng)依據(jù)，需要進(jìn)一步進(jìn)行有規(guī)律性的深化研究，歸納出完整的理論支撐；③對(duì)藍(lán)莓組織生理機(jī)能的研究也有待進(jìn)一步深化。

在今后藍(lán)莓組織培養(yǎng)的研究中，要繼續(xù)完善其技術(shù)方法，在不同品種間歸納出一套完整的理論依據(jù)，重點(diǎn)放在離體再生體系和轉(zhuǎn)化體系的研究，為基因的優(yōu)化、優(yōu)良種植資源的保存提供技術(shù)支撐。藍(lán)莓再生植株的發(fā)生機(jī)理和基因轉(zhuǎn)化育種等方面也具有極大的研究前景。

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（責(zé)任編輯 金蘋）

Research Progress of Blueberry Tissue Culture Technology

YU Qiao-zhiet al.(College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002)

Research status of blueberry tissue culture technology in China was summarized,and the establishment of the sterile system of different explants,explant culture and tube seedlings rooting culture in the process of blueberry tissue culture were introduced.The problems exiting in blueberry tissue culture were analyzed,at last,the prospect of the application of tissue culture technology in blueberry was given.

Blueberry;Tissue culture;Application

Q813.1

A

2095-0896（2015）06-079-03

于巧芝（1991-），女，河北石家莊人，本科生，專業(yè)：園藝。*通訊作者，研究員，博士生導(dǎo)師，博士，從事園藝植物生物技術(shù)與遺傳資源研究。

2015-04-21