陳洪超(綜述)，曾維政(審校)

(成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內科，成都 610083)

中藥單體誘導間充質干細胞定向分化研究進展

陳洪超(綜述)，曾維政※(審校)

(成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內科，成都 610083)

摘要：間充質干細胞(MSCs)具有自我更新和多向分化能力，應用前景廣闊。利用誘導劑誘導MSCs定向分化是干細胞研究領域的關鍵。中藥單體成分多樣，結構明確，活性廣泛。應用中藥單體誘導干細胞定向分化成為中藥研究的新熱點。該文對近年來中藥單體誘導MSCs向成骨細胞、神經樣細胞、心肌細胞、肝樣細胞的定向分化研究進行綜述，為中藥深入開發(fā)提供新思路。

關鍵詞：中藥單體；間充質干細胞；定向分化

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于發(fā)育早期中胚層的一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞[1]。MSCs具有多向分化的潛能，不僅能分化成中胚層起源的多種組織細胞(如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等)，而且在適宜條件下跨組織分化為肝細胞、神經細胞、心肌細胞、上皮細胞、肺、小腸細胞等，并具有相應的功能[2-4]。MSCs對損傷的組織和器官具有修復作用，對其研究開發(fā)成為組織工程、細胞工程、細胞治療及基因治療等領域的研究熱點。傳統(tǒng)中藥取材方便，使用安全，在治療人類疾病和保障健康方面具有不可替代的作用。中藥單體復雜多樣，活性廣泛。近年來，利用中藥單體定向誘導MSCs的研究成為中藥研究的新熱點，許多研究者對中藥單體定向誘導MSCs進行了探索性研究?，F(xiàn)對中藥單體誘導MSCS定向分化研究進展進行綜述。

1中藥單體誘導MSCs向成骨細胞分化

各種原因引起的骨缺損后期修復是骨科領域的難題之一，但長期以來中醫(yī)藥治療骨折愈合療效顯著，具有較高的安全性。聯(lián)合中藥和MSCs，利用中藥單體誘導MSCs向成骨細胞定向分化對此難題的解決具有積極意義。體外培養(yǎng)MSCs使其向成骨細胞分化，主要依賴于一定的培養(yǎng)條件，因此控制好培養(yǎng)條件是體外誘導分化為成骨細胞的關鍵。誘導MSCs成骨分化的中藥單體篩選多來源于抗骨質疏松中藥。

1.1中藥淫羊藿單體成分翟遠坤等[5]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿次苷Ⅱ可通過提高誘導性一氧化氮合酶活性，促進一氧化氮生成，激活NO信號通路，促進MSCs向成骨細胞分化。楊麗等[6]研究提示，上調轉化生長因子β1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的表達量可能是淫羊藿苷誘導促進MSCs骨向分化的作用機制之一。張錦芳等[7]研究表明，Wnt信號通路抑制劑DKK-1能部分抑制淫羊藿黃酮誘導MSCs的成骨效果，說明Wnt信號通路參與了其誘導成骨分化的過程。

1.2中藥蛇床子單體成分明磊國等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素能提高MSCs的堿性磷酸酶活性，促進骨鈣素分泌、鈣鹽沉積量，增加鈣化結節(jié)數(shù)量，提高堿性成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子1、成骨細胞鋅指結構轉錄因子和Runt相關轉錄因子2的mRNA表達水平，明顯促進其向成骨性分化，證明蛇床子素是中藥蛇床子抗骨質疏松的有效成分。蛇床子素濃度高于10-4mol/L時對細胞有強烈抑制甚至有毒害作用，其中1×10-5mol/L組促進MSCs的成骨性分化能力最強[8]。

1.3其他抗骨質疏松中藥單體成分尚希福等[9]用茶黃素、楊淵等[10]用柚皮苷、武密山等[11]用川續(xù)斷皂苷Ⅵ體外均成功誘導 MSCs定向分化為成骨細胞，川續(xù)斷皂苷Ⅵ促進MSCs向成骨細胞增殖和分化的作用可能與其升高核心結合因子亞單位1 mRNA的表達有關。

2中藥單體誘導MSCs向神經細胞分化

近幾年，國內在用中藥單體誘導MSCs分化為神經元樣細胞方面進行了嘗試?？寡趸饔每赡苁侵兴巻误w產生定向誘導的主要原因之一，作為鈣離子拮抗劑或鈣離子通道阻斷劑保護神經元也是一些中藥單體起效的影響因素。

2.1具有抗氧化作用的丹參單體成分余勤等[12]用丹參素誘導骨髓MSCs，其中堿性成纖維細胞生長因子可能參與了MSCs向神經元分化的啟動，而丹參素在其后向神經元樣細胞轉化及擴增中起重要作用。夏文杰等[13-14]用丹參酮ⅡA、隱丹參酮均成功誘導MSCs在體外分化為神經元樣細胞。丹參有效成分丹參素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮，均具有抗氧化作用，其作用機制可能是抑制環(huán)核甘酸磷酸二酯酶的活力，提高胞內cAMP環(huán)核苷酸水平，后者進一步激活cAMP依賴蛋白激酶、p38、細胞外調節(jié)蛋白激酶1和2等信號轉導，最終引起神經突起發(fā)生和延長。

2.2具有鈣離子拮抗劑作用的單體成分川芎嗪是從川芎中提取的一種生物堿單體，是一種新型的鈣離子拮抗劑，對中樞神經系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用，可保護視神經，促進骨髓移植后造血重建等作用。劉云云等[15]研究表明，川芎嗪具有體外誘導MSCs分化為神經元樣細胞的作用。人參皂苷RgⅠ具有鈣離子拮抗作用，對神經元有保護作用。鄔偉等[16]研究表明，人參皂苷RgⅠ可以在體外誘導MSCs分化為神經元樣細胞，并且可能表達神經生長因子mRNA。

2.3其他具有神經元樣細胞誘導作用的單體成分汪泱等[17]用阿魏酸鈉、黃家貴等[18]用白藜蘆醇、項平和李海標[19]用黃連素、潘國強等[20]用金雀異黃素體外分別誘導MSCs成功向神經元樣細胞分化。顏曉華和黃瑞濱[21]用黃芩苷在體外成功誘導MSCs分化為神經細胞，低濃度的黃芩苷體外擴增在一定程度上起到了預誘導分化作用，黃芩苷誘導作用溫和、穩(wěn)定而持久，誘導出的神經元樣細胞成活時間長，其誘導機制可能與黃芩苷的抗氧化、調控細胞核因子κB的活性從而刺激多種細胞因子的表達和生成有關。蘇平等[22]研究顯示，銀杏內酯B誘導的MSCs不僅具有神經細胞的外形和免疫學特征，而且具有神經元的基本電生理功能。

3中藥單體誘導MSCs向心肌細胞分化

常用的心肌細胞體外誘導劑5-氮胞苷是抗腫瘤制劑，其心肌細胞的分化率很低，臨床安全性和長期有效性難以實現(xiàn)。而中藥具有臨床應用安全性和長期有效性的特點，因此國內學者對中藥單體誘導MSCs分化為心肌細胞進行了相關探索。季紅等[23]將MSCs分為4組：空白對照組、5-氮胞苷組、丹酚酸B組、5-氮胞苷聯(lián)合丹酚酸B組進行誘導，誘導4周。誘導分化后的各組不同程度的陽性表達心肌細胞特異性蛋白心肌肌鈣蛋白T，誘導組糖原合成激酶基因表達上調，β-聯(lián)蛋白基因表達下調。丹酚酸B促進MSCs向心肌細胞分化，伴有Wnt經典信號通路的抑制。

冼紹祥等[24]對MSCs進行分組誘導：黃芪甲苷組(終濃度為250 mg/L)、5-氮胞苷組(終濃度為10 μmol/L)、黃芪甲苷加5-氮胞苷組(終濃度分別為250 mg/L、10 μmol/L)，誘導后繼續(xù)培養(yǎng)4周。誘導后細胞呈梭形，并出現(xiàn)肌管；各組在不同時間的心肌樣細胞誘導率無明顯差異；誘導后MSCs表達心肌特異性結蛋白、肌鈣蛋白I和成熟的心肌特異性蛋白心肌肌球蛋白重鏈、心肌肌球蛋白重鏈。但黃芪甲苷誘導MSCs定向分化為心肌樣細胞的誘導率仍有待提高。

4中藥單體誘導MSCs向肝樣細胞分化

肝臟疾病是嚴重危害人類健康的一類疾病，是人類疾病死亡的主要原因之一。目前，肝移植仍然是臨床上治療中晚期肝臟疾病的最后手段，但由于供肝來源困難、免疫抑制劑的終生應用及昂貴的手術費用等諸多因素，大大限制了肝移植在臨床上的普及應用。干細胞移植作為一種新興起的先進療法，與肝臟移植相比，具有手術簡單、創(chuàng)傷小、費用低廉、來源相對豐富、細胞可以儲備及免疫原性弱等諸多優(yōu)點。

當前，誘導MSCs向肝樣細胞分化常用誘導劑肝細胞生長因子是個多效應的生長因子，其作用的多效性相應降低了干細胞肝向分化的專一性，使誘導所得的肝樣細胞數(shù)量低于預期。因此，從對肝功能具有保護作用和對肝臟損傷有一定臨床治療作用的中藥中尋找誘導干細胞肝樣分化的有效成分，將其單獨或聯(lián)合應用誘導干細胞向肝樣細胞分化具有重要意義。

黃偉等[25]研究顯示，在紅景天苷單獨誘導作用下MSCs在體外能轉化為肝樣細胞，與單用肝細胞生長因子、紅景天苷相比，兩者聯(lián)合應用可增強臍血MSCs向肝樣細胞分化的誘導作用，其中以10 mol/L紅景天苷聯(lián)合10 μg/L肝細胞生長因子的誘導效果最佳。此后，杜超等[26]研究也表明，紅景天苷能誘導MSCs向肝樣細胞分化，紅景天苷聯(lián)合淤膽血清能更有效地誘導MSCs向肝樣細胞分化。而Ouyang等[27]對紅景天苷定向誘導MSCs向肝樣細胞分化機制進行研究，發(fā)現(xiàn)誘導過程中加入細胞外調節(jié)蛋白激酶1和2、p38以及磷脂酰肌醇3-激酶信號轉導通路抑制劑，3條信號通路均有參與，磷脂酰肌醇3-激酶信號轉導通路起主要作用。陳艷等[28]研究表明，20 μmol/L姜黃素能單獨誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為肝細胞，與成纖維細胞生長因子4聯(lián)合應用可使姜黃素的誘導濃度降低，效果更好，安全性更可靠。

5問題與展望

雖然中藥單體在體外誘導MSCs定向分化方面已有較多成功的實驗報道，但要將其應用于臨床，仍有諸多問題亟待解決。已證實的在體外具有誘導MSCs定向分化的中藥單體誘導效果如何？誘導分化的細胞是否具有相應的生理功能？能否在體內試驗中同樣誘導MSCs產生定向分化？目前對中藥單體誘導MSCs定向分化機制研究過于簡單，多為描述性研究，仍有待深入研究。

誘導分化機制研究方面，已有研究開始利用基因芯片技術對中藥單體誘導MSCs的機制進行研究，通過基因芯片技術尋找與分化相關的信號通路，進而利用基因和蛋白等分子生物學技術對各相關信號通路進行驗證和研究[29]。磁性納米粒子體外標記MSCs等技術的發(fā)展則實現(xiàn)了對干細胞移植后在體內的分化與分布進行實時監(jiān)控，對中藥單體誘導MSCs體內分化的效果進行評價[30]。在今后的研究中，如何建立高效的中藥誘導MSCs分化篩選體系是研究開發(fā)的關鍵。高通量篩選對MSCs分化具有明顯作用的中藥有效成分，進而對MSCs誘導過程中細胞分化方向、信號通路及誘導分化機制進行更加深入的研究。通過上述相關研究，有望從中藥中開發(fā)出促進MSCs定向分化的有效藥物，對中藥現(xiàn)代化研究與開發(fā)具有重要意義。

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Research Advances on the Oriented Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Induced by Chinese Medicinal MonomersCHENHong-chao,ZENGWei-zheng.(DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Chengdu610083,China)

Abstract:Mesenchymal stem cells(MSCs) are a group of cells with the capability of self-renewal and potential of multilineage differentiation,which have broad application prospects.Oriented differentiation of MSCs induced by revulsant is a key point in the field of stem cell research.Chinese medicinal monomers are diverse and have widespread activity.Application research of the oriented differentiation of MSCs induced by Chinese medicinal monomers has become a new hotspot.Here reviews some progresses on osteoblasts,neurons-like cells,cardiomyogenic cells,hepatocyte-like cells differentiation of MSCs induced by some Chinese medicinal monomers in recent years,providing new ideas for further development of traditional Chinese medicine.

Key words:Chinese medicinal monomers; Mesenchymal stem cell; Oriented differentiation

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-04-20編輯：伊姍

基金項目：成都軍區(qū)總醫(yī)院院管重點課題(2013YG-A008)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.016

中圖分類號：R691

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4075-03