李根林， 李 竹， 吳宿慧， 李寒冰， 張顏語， 呂 寧， 韓素月， 王晨琳， 楊 陽

（河南中醫(yī)學院藥學院，河南鄭州450008）

微孔板和分光光度計法檢測7種食用菌的抗氧化活性

李根林， 李 竹， 吳宿慧*， 李寒冰， 張顏語， 呂 寧， 韓素月， 王晨琳， 楊 陽

（河南中醫(yī)學院藥學院，河南鄭州450008）

目的 建立微量檢測食用菌體外清除二苯代苦味?；杂苫?（DPPH·）活性的方法，并比較常見食用菌的抗氧化活性，為尋找天然抗氧化劑提供初步的篩選方法和技術(shù)資料。方法 超聲提取得到香菇等7種食用菌和火麻仁的提取物后，采用微孔板與分光光度計法測定其DPPH·清除率，然后對這兩種方法的測定結(jié)果進行曲線擬合，并對實驗耗時、試劑用量和方法重復(fù)性方面進行對比，進而比較其DPPH·清除活性。結(jié)果 兩種方法所得的DPPH·清除率無統(tǒng)計學差異，但在實驗耗時、試劑用量等方面，微孔板法有明顯優(yōu)勢。另外，食用菌水提物的抗氧化活性均明顯高于醇提物，其中香菇水提物的活性最高。結(jié)論 微孔板法測定食用菌DPPH·的清除活性時具有準確、快捷、重復(fù)性好等特點，而且食用菇水溶性成分的抗氧化活性大于醇溶性成分，可為后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)資料。

食用菌；抗氧化活性；微孔板；分光光度計；DPPH·

自由基是機體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性，當體內(nèi)代謝產(chǎn)物的自由基過多或清除能力下降時，會導致生物細胞氧化性損傷，引發(fā)心血管疾病、癌癥等各種病變［1］，因此清除體內(nèi)外過量自由基有著重要意義，而多種食用菌具有確切的體外抗氧化活性［2］。目前，分光光度計法［3］作為一種經(jīng)典的抗氧化實驗方法，廣泛應(yīng)用于藥品和食品的檢測，其簡便易行［4-7］，但測試大規(guī)模樣品時存在耗時長、有機溶劑消耗大等缺陷，因此建立一種快速、精確、低成本的抗氧化活性測定方法具有廣闊的應(yīng)用前景。本實驗對分光光度計法進行改良，并以陽性對照品維生素E（VE）、具有DPPH·清除作用的火麻仁及香菇為研究對象，建立微孔板法對香菇等7種食用菌進行體外抗氧化活性測定，期冀為其活性初篩和相關(guān)機能食品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 樣品購自河南省鄭州市農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)河南中醫(yī)學院陳隨清教授鑒定，分別為真菌類擔子菌綱傘菌目傘菌科香蕈Lentinus edodes（Berk.）Sing的子實體香菇、擔子剛傘菌目側(cè)耳科真菌糙皮側(cè)耳Pleurotus ostreatus（Jacq.ex Fr.）Quel的子實體平菇、層菌綱傘菌目側(cè)耳科真菌刺芹側(cè)耳Pleurotus eryngii的子實體杏鮑菇、傘菌目白蘑科真菌冬菇Flammulina velutiper（Fr.）Sing的子實體金針菇、層菌綱傘菌目白蘑科真菌真姬菇Hypsizygusmarmoreus（Peck）H.E.Bigelow不同品種的子實體白玉菇、蟹味菇、海鮮菇。

火麻仁購自鄭州本草國藥館，經(jīng)河南中醫(yī)學院陳隨清教授鑒定，為桑科植物大麻Cannabissativa L的干燥成熟果實。

二苯代苦味酰基自由基（DPPH·，批號STBC5116V，美國Sigma公司）；天然型維生素E膠丸 （批號20131008，青島雙鯨藥業(yè)有限公司）。無水乙醇為分析純 （批號20130630，天津市凱通化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器設(shè)備 96孔細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）；分析天平 （德國賽多利斯公司）；100～200目藥材粉碎機 （北京中儀泓瑞科技發(fā)展有限公司）；Dragon移液器（北京智杰方遠科技有限公司）；VIS-7220N可見分光光度計（北京瑞麗分析儀器有限公司）；Multiskan GO全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；KQ-250DE數(shù)控

超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D循環(huán)真空泵 （鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理 取食用菌適量，去除表面殘留的培養(yǎng)基等雜質(zhì)，洗凈，60℃下干燥，粉碎，過60目篩，密封備用。另取火麻仁適量，去皮搗碎，過60目篩，密封備用。

1.3.2 DPPH·溶液的制備［8-9］精密稱取DPPH·0.020 1 g，置于250 mL量瓶中，無水乙醇定容至250 mL，搖勻，即得0.2 mmol/L DPPH·溶液，4℃下避光保存，備用。

1.3.3 陽性對照品維生素E（VE）溶液的制備［8-9］取維生素E膠丸4粒 （每粒含VE 100 mg），剪破膠丸殼，加入無水乙醇5 mL溶解，搖勻，即得80 mg/mL VE溶液。

1.3.4 樣品制備 稱取食用菌干粉 （30.000±0.001）g兩份，分別加入20倍量雙蒸水和無水乙醇，超聲提取25 min（25℃、20 kHz），抽濾，提取液濃縮至1 000 mg/mL，4℃下保存?zhèn)溆??；鹇槿蕵悠返闹苽浞椒ㄅc食用菌相同。

1.3.5 微孔板法 以VE、食用菌香菇水提物、火麻仁醇提物為受試品，每份設(shè)置3組，即對照組、樣品組、空白組（消除樣品背景色），分別加樣于96孔細胞培養(yǎng)板中。其中，樣品組加入0.5倍梯度稀釋的不同濃度受試品溶液100μL和DPPH·溶液100μL，每孔反應(yīng)體系200μL；空白組以等體積無水乙醇代替DPPH·溶液；對照組以等體積蒸餾水或無水乙醇代替受試品溶液，加樣方法及加樣量見表1。加樣結(jié)束后，室溫下避光反應(yīng)30 min，酶標儀在517 nm波長下測定吸光度3次，取平均值，計算DPPH·的清除率。

表1 各組加樣方法與加樣量

1.3.6 分光光度計法［8-10］反應(yīng)于10 mL離心管中進行，各試劑加樣方法同 “1.3.5”項，但加樣量均為3 mL，每管反應(yīng)體系均為6 mL，室溫下避光反應(yīng)30 m in，然后可見分光光度計在517 nm波長下測定吸光度3次，取平均值，計算DPPH·的清除率。

1.3.7 測定方法擬合 對 “1.3.5”和 “1.3.6”項下兩種方法所得的結(jié)果進行曲線擬合，并進行重復(fù)性實驗以比較兩者的RSD。

1.3.8 微孔板法測定食用菇的抗氧化活性 按 “1.3.5”項下方法，對7種食用菌提取物的DPPH·清除率進行測定。

1.3.9 計算方法 計算公式為DPPH·清除率=［Ac-（A-Aj）］/Ac×100%，Reed Muench法計算IC50，SPSS 19.0軟件進行曲線擬合，Microsoft Excel 2010軟件計算相對標準偏差 （RSD）。

2 結(jié)果

2.1 曲線擬合模型的建立 維生素E作為標準物質(zhì)，分別以微孔板和分光光度計法所得清除率為因變量，受試品溶液濃度為自變量，建立曲線擬合模型，SPSS 19.0軟件進行擬合，并加以比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對數(shù)模型的統(tǒng)計學意義優(yōu)于其他模型，因此對對數(shù)模型參數(shù)進行描述。

在微孔板法的對數(shù)模型單因素方差分析（one-way ANOVA）中，F(xiàn)（1，4）=71.402，P＜0.001，對模型中系數(shù)和常數(shù)的統(tǒng)計學意義進行考察時發(fā)現(xiàn)，系數(shù)23.300的t= 8.450，P＜0.001，而常數(shù)22.441的t=4.702，P＜0.01，表明該模型具有顯著的統(tǒng)計學意義，可用于實驗分析。另外，模型的決定系數(shù)R=0.973，公式為y=23.3Ln（x）+22.441。

在分光光度計法的對數(shù)模型one-way ANOVA中，F(xiàn)（1，4）=79.981，P＜0.001，對模型中系數(shù)和常數(shù)的統(tǒng)計學意義進行考察時發(fā)現(xiàn)，系數(shù)23.895的t=8.943，P＜0.001，而常數(shù)20.768的t=4.491，P＜0.05，表明該模型具有顯著的統(tǒng)計學意義，可用于實驗分析。另外，模型的決定系數(shù)R=0.976，公式為y=23.895Ln（x）+20.768，見圖1和表2。

圖1 維生素E水提物微孔板法與分光光度計法的擬合曲線

表2 維生素E曲線擬合的方法學考察

為了驗證模型的可行性，本實驗選擇抗氧化活性已知的火麻仁油 （標準受試品）及未知的香菇進行曲線擬合。結(jié)果表明，火麻仁醇提物微孔板法的模型公式為y= 22.425Ln（x）-43.828，分光光度計法的模型公式為y= 22.245Ln（x）-43.167；香菇水提物微孔板法的模型公式為y=19.182Ln（x）+31.168，分光光度計法的模型公式為y=20.139Ln（x）+30.049，而且均具有顯著的統(tǒng)計學意義，見圖2、圖3、表3。

2.2 微孔板和分光光度計法的差異比較 微孔板和分光光度計法所得的3種受試品的DPPH·清除率量效關(guān)系擬合曲線的相似度較高，重疊率也很高，見圖1～圖3，可認為

兩種方法的結(jié)果一致。另外，還對這兩種方法在實驗耗時、試劑用量和重復(fù)性方面進行比較，見表4，可知兩種測定方法所得的IC50值相當；在實驗耗時方面，微孔板法約40～45 min，而分光光度計法約55～60 min，但由于前者的反應(yīng)體系在96孔板中進行，理論上可以一次測定96個樣品，而后者一次只能測定一個樣品，因此在大規(guī)模樣品篩選時，微孔板法的測定效率將顯著提高；在試劑用量方面，微孔板法只有分光光度計法的3.33%左右；在重復(fù)性實驗中，各組樣品間RSD值差異不大，說明這兩種方法在多次測定同一樣品時的結(jié)果變異小，重復(fù)性好。

圖2 香菇水提物微孔板法與分光光度計法的擬合曲線

圖3 火麻仁醇提物微孔板法與分光光度計法的擬合曲線

表3 曲線擬合的方法學考察

2.3 微孔板法測定7種食用菌水提物的體外抗氧化活性（圖4） 由圖可知，其半對數(shù)量效關(guān)系曲線均呈明顯的“S”型，與陽性對照藥VE的趨勢相同。由此說明，它們均具有體外清除DPPH·的能力，而且香菇水提物的抗氧化活性明顯高于其他食用菌。

表4 3種受試品微孔板與分光光度計法的相關(guān)指標對比（n=8）

圖4 7種食用菌水提物抗氧化活性對比

2.4 微孔板法測定7種食用菌醇提物的體外抗氧化活性（圖5） 由圖可知，其半對數(shù)量效關(guān)系曲線也均呈明顯的“S”型，與陽性對照藥VE的趨勢也相同。由此說明，醇提物也有一定的抗氧化活性。

圖5 7種食用菌醇提物體外抗氧化活性對比

2.5 7種食用菌水提物和醇提物的體外抗氧化活性比較（表5） 由表可知，食用菌水提物的抗氧化活性依次為香菇＞平菇＞白玉菇＞杏鮑菇＞海鮮菇＞金針菇＞蟹味菇，而醇提物依次為白玉菇＞平菇＞香菇＞海鮮菇＞杏鮑菇＞金針菇＞蟹味菇。由此說明，香菇水提液 （2.81 mg/mL）的抗氧化活性最高，而且7種食用菌水提物的IC50值均明顯低于醇提物，說明前者的體外抗氧化活性大于后者。

3 結(jié)果與討論

本實驗在傳統(tǒng)分光光度計法測定體外抗氧化活性的基礎(chǔ)上，建立了微孔板法篩選模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法與分光光度計法相比，具有操作簡便、測試速度快、耗費試劑少、精確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，并克服了傳統(tǒng)方法操作費時、溶劑量大、成本高等不足，與文獻 ［11］報道一致。因此，微孔板法適合大規(guī)模樣品初篩，具有良好的實用性，尤其是對微量天然產(chǎn)物 （如食用菌等）抗氧化活性的測試。

表5 7種食用菌水提物和醇提物DPPH·清除率的IC50值（mg/m L）

另外，實驗結(jié)果顯示，7種食用菌水提物與醇提物的抗氧化活性有明顯差異，水提物的抗氧化活性明顯大于醇提物，并且香菇水提物的活性最高，這為尋找天然抗氧化劑提供了參考，也為香菇等食用菌的進一步開發(fā)和利用提供了技術(shù)依據(jù)。

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1001-1528（2015）12-2772-04

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2014-12-25

國家自然科學基金面上項目 （81473435）；河南省高等學校青年骨干教師資助計劃項目 （2013GGJS-092）；河南省教育廳科學技術(shù)重點資助項目 （14A310023）；河南中醫(yī)學院研究生創(chuàng)新基金項目 （2014YCX009）；河南中醫(yī)學院藥學院大學生創(chuàng)新學習項目 （YXCX［2014］22）

李根林 （1963—），男，教授，碩士生導師，從事中藥生物活性評價研究。Tel：13703920231，E-mail：lhb9988@163.com

*通信作者：吳宿慧 （1980—），女，講師，從事中藥藥理學研究。Tel：（0371）65962746，E-mail：iwusuhui@163.com