周防震， 鄭小江， 張曉元

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施445000；2.華南理工大學(xué)工業(yè)研究總院，廣東廣州510641）

藤茶活性成分二氫楊梅素對(duì)人胚腎細(xì)胞和肝細(xì)胞增殖的影響

周防震1， 鄭小江1， 張曉元2

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施445000；2.華南理工大學(xué)工業(yè)研究總院，廣東廣州510641）

目的 探討藤茶活性成分二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）對(duì)人正常細(xì)胞增殖的影響。方法 體外培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞（HEK-293）和肝細(xì)胞（L-02），MTT法觀察DMY對(duì)其細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 DMY對(duì)HEK-293和L-02細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為475.3μg/mL和324.8μg/mL，而陽性對(duì)照藥物順鉑的IC50分別為7.4μg/mL和7.7μg/mL。結(jié)論 藤茶活性成分二氫楊梅素對(duì)人正常細(xì)胞HEK-293和人L-02細(xì)胞具有相對(duì)低毒性。

藤茶；二氫楊梅素；細(xì)胞增殖；人胚腎細(xì)胞；人肝細(xì)胞

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY），大量存在于葡萄科蛇葡萄屬植物藤茶（Ampelopsis grossedentata）幼嫩莖葉中。報(bào)道表明二氫楊梅素具有抗氧化、抗炎、抗突變、止咳、化痰和抗菌等多種生理活性［1］。近年來二氫楊梅素的抗腫瘤作用日益受到重視，資料顯示二氫楊梅素對(duì)人鼻咽癌HK-1細(xì)胞［2］、白血病HL-60、K562細(xì)胞［3］、肺腺癌AGZY-83-a細(xì)胞［4］和人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞［5-6］具有較強(qiáng)的增殖抑制作用，然而有關(guān)二氫楊梅素對(duì)人正常細(xì)胞影響方面的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以人胚腎細(xì)胞 （HEK-293）和人肝細(xì)胞 （L-02）為研究對(duì)象，研究藤茶活性成分二氫楊梅素對(duì)其體外增殖的影響，以期為二氫楊梅素的開發(fā)和應(yīng)用開拓新的視野。

1 材料與方法

1.1 材料 二氫楊梅素由華南理工大學(xué)工業(yè)技術(shù)研究總院張曉元教授從藤茶莖葉中提取 （純度為98%，HPLC法測(cè)定）；細(xì)胞培養(yǎng)基 （DMEM）、胎牛血清 （FBS）為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；注射用順鉑（Cisplatin）購(gòu)自齊魯制藥有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。HEK-293由湖南中醫(yī)藥大學(xué)高強(qiáng)博士提供；L-02細(xì)胞由暨南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院段華英碩士提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 以每孔4×103的細(xì)胞密度將指數(shù)增殖期細(xì)胞HEK-293和L-02分別接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM，每孔180μL，培養(yǎng)12 h后，每孔加入20μL含不同二氫楊梅素濃度的DMEM完全培養(yǎng)液，二氫楊梅素終質(zhì)量濃度為20、40、80、160和 320 μg/mL每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。另設(shè)空白對(duì)照組和陽性藥物順鉑組。細(xì)胞置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，待用。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取出“1.2.1”項(xiàng)中培養(yǎng)48 h的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入DMSO 200μL，置振蕩儀上充分混勻，采用酶標(biāo)儀，以570 nm為測(cè)試波長(zhǎng)，630 nm為參考波長(zhǎng)，測(cè)量各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率為：（對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 半數(shù)抑制濃度IC50（50%Inhibitory Concentration）根據(jù)IC50計(jì)算軟件計(jì)算；試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包中的One-way ANOVA（單因素方差分析）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 二氫楊梅素和順鉑對(duì)HEK-293細(xì)胞增殖的影響 作用48 h，100～180μg/mL的二氫楊梅素對(duì)HEK-293增殖具有顯著的抑制作用；低于60μg/mL的二氫楊梅素對(duì)人HEK-293增殖的影響，與對(duì)照組相比不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （圖1）；而5～40μg/mL順鉑對(duì)HEK-293均有顯著的抑制作用（圖2）。

2.2 二氫楊梅素和順鉑對(duì)L-02細(xì)胞增殖的影響 作用48 h，40～160μg/mL二氫楊梅素對(duì)L-02細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用；低于40μg/mL的二氫楊梅素對(duì)L-02細(xì)胞增殖的影響，與對(duì)照組相比不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （圖3）；而0.625～20μg/mL順鉑對(duì)L-02細(xì)胞均有顯著的抑制作用（圖4）。

2.3 二氫楊梅素和順鉑對(duì)HEK-293和L-02細(xì)胞的IC50二氫楊梅素對(duì)HEK-293和L-02細(xì)胞的IC50分別為475.3和324.8μg/mL；而順鉑對(duì)HEK-293和L-02細(xì)胞的IC50分別為7.4和7.7μg/mL（表1）。

圖1 二氫楊梅素對(duì)HEK-293增殖的影響

圖2 順鉑對(duì)HEK-293增殖的影響

圖3 二氫楊梅素對(duì)L-02細(xì)胞增殖的影響

圖4 順鉑對(duì)L-02細(xì)胞增殖的影響

3 討論

肝和腎是人體重要的器官，對(duì)維持正常生理平衡具有十分重要的作用。許多化療藥物缺乏對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的選擇性，不僅可能破壞免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤的自我保護(hù)屏障喪失，而且能損害人體肝、腎等重要器官，進(jìn)而影響其功能，對(duì)人體毒副作用大，嚴(yán)重地影響了藥物的臨床效果［7］。

表1 二氫楊梅素和順鉑對(duì)HEK-293和L-02細(xì)胞的IC50

前期研究發(fā)現(xiàn)，順鉑對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的IC50為2.53μg/mL（數(shù)據(jù)待發(fā)表），本試驗(yàn)中化療藥物順鉑對(duì)人胚腎細(xì)胞HEK-293和人肝細(xì)胞L-02的IC50分別為7.4μg/mL和7.7μg/mL，表明化療藥物順鉑細(xì)胞選擇性較差，具有明顯的肝、腎毒性，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8-9］。蘇東林等［10］利用大鼠從活體水平證明了二氫楊梅素的低毒性，Wistar大鼠口服灌胃的最大耐受量為5.0 g/kg，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素能有效預(yù)防和治療酒精性肝損傷。張友勝等［11］利用小鼠從活體水平證明了二氫楊梅素的低毒性，小鼠灌胃最大耐受量5.0 g/kg，腹腔注射半數(shù)致死量為（1.41±0.13）g/kg。本研究離體條件下藤茶活性成分二氫楊梅素對(duì)人正常腎細(xì)胞和肝細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示二氫楊梅素對(duì)HEK-293和L-02細(xì)胞的IC50分別為475.3 μg/mL和324.8μg/mL，表明離體條件下二氫楊梅素對(duì)人正常細(xì)胞HEK-293和人L-02細(xì)胞具有相對(duì)低毒性。以前的研究［5］發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的IC50為73.6μg/m L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于二氫楊梅素對(duì)人胚腎細(xì)胞HEK-293和人肝細(xì)胞L-02的IC50，表明二氫楊梅素不僅具有低毒性，其抗腫瘤作用還具有明顯的細(xì)胞選擇性。

藤茶是一種古老的藥食兩用植物，長(zhǎng)期作為類茶植物和中草藥在民間廣泛使用，其干燥莖葉中二氫楊梅素的含量可達(dá)30%以上［12］。近年來，藤茶已逐漸被人們所接受并成為受人們青睞的保健品。本研究從離體條件證明了二氫楊梅素對(duì)人正常肝、腎細(xì)胞的低毒性，豐富了藤茶安全性的新認(rèn)識(shí)，有助于進(jìn)一步增強(qiáng)市場(chǎng)和消費(fèi)者對(duì)藤茶的信心，進(jìn)而加快藤茶的開發(fā)和利用步伐。

［1］ 周防震，張曉元，郭 勇.二氫楊梅素抗腫瘤及其機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（9）：1914-1916.

［2］ 周寧寧，朱孝峰，謝冰芬.無刺根中蛇葡萄素體外抗腫瘤作用研究［J］.廣東藥學(xué)，2000，10（4）：7-8.

［3］ Jeon S H，Chun W，Choi Y J，et al.Cytotoxic constituents from the bark of Salix hulteni［J］.Arch Pharm Res，2008，31（8）：978-982.

［4］ 尹梅梅，潘振偉，蔡本志，等.二氫楊梅素誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GZY-83-a凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24（5）：626-630.

［5］ 周防震，張曉元，孫奮勇，郭 勇.二氫楊梅素對(duì)人乳腺癌

細(xì)胞MDA-MB-231的體外抗增殖作用［J］.腫瘤防治研究，2012，39（1）：95-97.

［6］ 周防震，張曉元，孫奮勇，等.二氫楊梅素誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào) （農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2012，38（3）：299-304.

［7］ Wang Y，He Q Y，Tsao S W，et al.Cytokeratin 8 silencing in human nasopharyngeal carcinoma cells leads to cisplatin sensitization［J］.Cancer Lett，2008，265（2）：188-196

［8］ 曾 健，勞 山.順鉑腎毒性機(jī)制及其防護(hù)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008，3（10）：194-195.

［9］ 趙 紅.還原型谷胱甘肽預(yù)防順鉑化療致肝腎功能損害104例觀察［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2007，36（9）：1213-1216.

［10］ 蘇東林，黃繼紅，姚茂君.二氫楊梅素的急性毒理學(xué)評(píng)價(jià)及對(duì)酒精性肝損傷的防治效果［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（11）：90-93.

［11］ 張友勝，寧正祥，胡閆勇.黃酮類化合物二氫楊梅素的研究利用現(xiàn)狀［J］.中成藥，2002，24（12）：970-972.

［12］ 徐靜娟，姚茂君，許 鋼.二氫楊梅素抗氧化功能的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（9）：43-45.

R285.5

B

1001-1528（2015）12-2756-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.040

2014-08-23

湖北民族學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目 （MY2012B010）

周防震 （1976—），男，博士，副教授，主要研究方向?yàn)槊腹こ膛c生物制藥，Tel：（0718）8438261，E-mail：tentzf.student @sina.com