黃 涵， 曾令杰， 馮鴻耀， 莫運才， 郭玉梅， 廖素溪

（廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006）

基于HPLC指紋圖譜與PLS-DA法評價新疆、云南產(chǎn)雪菊的質(zhì)量

黃 涵， 曾令杰*， 馮鴻耀， 莫運才， 郭玉梅， 廖素溪

（廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006）

目的 采用HPLC指紋圖譜和偏最小二乘判別分析 （PLS-DA）法對新疆、云南產(chǎn)雪菊質(zhì)量進行評價。方法

雪菊；質(zhì)量評價；分類；HPLC指紋圖譜；PLS-DA

雪菊Coreopsis tinctoria Nutt.學名兩色金雞菊，是菊科金雞菊屬一年生草本植物［1］，主要分布于新疆昆侖山山系，迄今報道其藥理作用主要包括抗炎［2］、 抗氧化［3-4］、 降脂［5-6］、 降壓［7-8］、 降糖［9-10］等。近年來，市場對雪菊的需求量劇增，由于該植物野生產(chǎn)量稀少，故為滿足需要，新疆 （尤其是和田地區(qū)）、云南部分地區(qū)有一定規(guī)模的栽培［11］。

在我國，雪菊作為一種茶飲很受歡迎，對其研究主要集中在化學成分、藥理活性等方面，該植物的質(zhì)量評價雖有相關(guān)報道，但是大多僅以幾種活性成分含有量為評價指標［12-13］。然而，雪菊化學成分較為復雜，若僅控制單一成分，難以保證臨床安全性和有效性，而且其指紋圖譜的研究尚未有文獻報道，因此有必要建立一種整體性的指紋圖譜測定方法，以更好地控制相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。

研究表明，偏最小二乘判別分析 （PLS-DA）法結(jié)合指紋圖譜在產(chǎn)地鑒別與質(zhì)量控制上具有一定優(yōu)勢，適合于樣品觀測數(shù)少、解釋變量多及存在著

多重共線性，而這些情況在中藥高效液相色譜數(shù)據(jù)中普遍存在［14］。尤為重要的是，當變量之間存在高度相關(guān)性時，采用PLS-DA法所得到的結(jié)論更可靠，整體性更強，如HPLC-UV指紋圖譜結(jié)合PLSDA法用于新疆桃仁的質(zhì)量控制及分類［15］、PLSDA法對不同產(chǎn)地杜仲葉的質(zhì)量評價［16］、GC-MS結(jié)合PLS-DA模型對小白杏仁油脂種類和品質(zhì)進行鑒別和監(jiān)控［17］等。

本實驗將運用HPLC指紋圖譜與PLS-DA法相結(jié)合的方式，用于實現(xiàn)新疆、云南兩個不同地區(qū)雪菊的分類，并根據(jù)PLS-DA模型的參數(shù)識別分類標志物，為深層次的雪菊質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料與儀器

島津LC-20AT HPLC色譜儀（包括四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器）、BP211b電子天平 （日本島津公司）；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗儀器 （昆山市超聲儀器有限公司）。綠原酸 （批號 MUST-13031401）、木犀草素 （批號MUST-13100401）對照品 （成都曼思特生物科技有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純。

20批雪菊分別采自新疆 （X1～X8）、云南（Y1～Y7）或購于市場 （S1～S5），經(jīng)廣東藥學院中藥學院曾令杰教授鑒定為菊科金雞菊屬植物兩色金雞菊Coreopsis tinctoria Nutt.的頭狀花序。樣本分為訓練集樣品 （共11個，包括6個新疆采集樣本X1～X6，5個云南采集樣本Y1～Y5）和驗證集樣本 （共9個，包括2個新疆采集樣本X7、X8，2個云南采集樣本Y6、Y7，5個市場樣本S1～S5），具體見表1。

2 方法與條件

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流動相為乙腈 （A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫 （0～10 min，10%～18%A；10～35 min，18%～70%A；35～50 min，70%A；50～60 min，70%～10%A；60～70 min，10% A）；檢測波長350 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 m L/min；進樣量10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取雪菊樣品適量，磨成粉末 （過3號篩），精密稱取0.25 g，置于50 m L具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，室溫下超聲提取50 min，再稱定質(zhì)量，70%乙醇補足減失質(zhì)量，搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

表1 雪菊樣品來源Tab.1 Sources of Coreopsis tinctoria sam p les

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、木犀草素對照品適量，70%乙醇溶解，制成分別含綠原酸、木犀草素0.99、0.96 mg/mL的對照品貯備液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液，連續(xù)進樣6次，以綠原酸、木犀草素為參照峰。結(jié)果，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.59%，相對峰面積RSD均小于1.43%，符合指紋圖譜的要求，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，每8 h測定1次，重復6次，以綠原酸、木犀草素為參照峰。結(jié)果，各共有峰相對保留時間RSD均小于1.39%，相對峰面積RSD均小于2.27%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 取同一供試品6份，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液進行分析，檢測指紋圖譜，以綠原酸、木犀草素為參照峰。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間RSD均＜0.73%，相對峰面積RSD均＜2.2%，表明該方法重復性良好。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜的相似度評價 將11批訓練集樣本

（X1～X6、Y1～Y5）的液相圖譜導入國家藥典委員會指定的 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”（圖1），將該軟件生成的雪菊共有模式與指紋圖譜對照，經(jīng)多點校正及色譜峰匹配，得到17個共有峰，匹配后進行相似度計算，結(jié)果見表2。由圖、表可知，各樣本之間或與對照圖譜的相似度較高，都在0.983以上，反映雪菊中化學成分的分布及比例比較穩(wěn)定。以訓練集樣本為例，它們與對照圖譜的相似度基本都在0.993以上，雖然均較高，但在圖中可觀察到樣品X1～X6與Y1～Y5的2、5、6、9、14、17號色譜峰的大小有所差異，其中X1～X6的2、6、9號峰明顯高于Y1～Y5，而5、14、17號峰明顯低于后者，這說明了色譜指紋圖譜不強調(diào)個體的絕對唯一性，而是注重同一藥材群體的相似性，即物種內(nèi)的唯一性，不分析樣品的實際情況，單純看相似度可能有歧義，如能結(jié)合判別分析則更有利于正確評價。另外，雖然該指紋圖譜符合要求，但通過相似度分析發(fā)現(xiàn)，樣品并未體現(xiàn)出很好的產(chǎn)地區(qū)分及質(zhì)量差異，盡管圖譜中主要峰群的整體面貌一致，但各成分含有量的相對比值不同，這可能受產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境、栽培因素等影響。

圖1 訓練集樣本 （X1～X6、Y1～Y5）的指紋圖譜和對照圖譜 （R）Fig.1 Fingerprints and referencemaps（R）of samples（X1-X6，Y1-Y5）in training set

表2 訓練集11批樣本的相似度Tab.2 Sim ilarities of eleven sam p les in training set

3.2 PLS-DA分析 本實驗以樣品中17個共有峰化學成分的含有量為X變量，以參與建模的各批雪菊樣品為Y變量，進行有監(jiān)督的PLS-DA分析。按照新疆、云南兩個產(chǎn)地的實際類別信息，將Y變量分為2類，建立HPLC色譜特征與其之間的PLS模型，峰面積數(shù)據(jù)經(jīng)SIMCA-P11.0軟件UV-scaling標準化預處理后進行分析。

首先，利用訓練集樣本建立PLS-DA識別模型，為驗證其對未知樣本的適用性，將9個驗證集樣本作為未知樣本，對模型進行檢驗，根據(jù)判別準確率及與訓練集判別是否一致來確定模型對未知樣本的適用性。然后，根據(jù)相關(guān)參數(shù)分別評價兩次建立的模型質(zhì)量。

在執(zhí)行多維統(tǒng)計分析建立PLS-DA模型時，軟件通常把數(shù)據(jù)分為7組，以其中6組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)計算一個基本模型，用于預測另一組的準確程度，并反復多次 （被預測的那組不重復）［18］，最后建立的模型是綜合所有模型的結(jié)果。由此，產(chǎn)生了評價模型的一些參數(shù)，如監(jiān)督模型解釋率 （R2Y）、模型預測能力 （Q2）［19］，理論上R2Y、Q2數(shù)值越接近1，說明模型越好，通常兩者高于0.5（50%）時較好。此外，置換檢驗是用來評價PLS-DA模型準確性的隨機排序方法，可避免監(jiān)督性方法獲得分類的偶然性。

圖2A為新疆、云南兩個地區(qū)PLS-DA模型訓練集樣本的得分圖。實驗結(jié)果表明，兩個地區(qū)的訓練樣本被明顯區(qū)分，判別準確率為100%，其中R2Y=0.993，Q2=0.978，可見該模型穩(wěn)定，預測能力較好。將模型建立時定義的分類Y矩陣的變量隨機排列20次，得到隨機的不同相應Q2值作為衡量模型是否過擬合的標準。通過置換檢驗，發(fā)現(xiàn)R2=0.321，Q2=-0.41，Q2負值表明模型可靠，

未存在過擬合現(xiàn)象，見圖2B。

然后，利用訓練集和9個驗證集作為未知樣本的驗證集樣本一起建立模型。由圖3C可知，所有新疆產(chǎn)地樣本均被正確地判定為I類，云南產(chǎn)地樣本被判定為Ⅱ類，這與訓練集判別結(jié)果一致，判別準確率為100%。其中，R2Y=0.900，Q2=0.851，表明該模型有較高的穩(wěn)定性和預測率；20次置換檢驗中，R2=0.197，Q2=-0.405（圖3D），表明模型未過擬合。綜上所述，利用指紋圖譜結(jié)合PLS-DA法可對新疆、云南產(chǎn)雪菊進行有效識別，為進一步分析其內(nèi)在質(zhì)量差異提供基礎(chǔ)。

同時，為獲得影響新疆、云南兩個產(chǎn)地分類的變量 （色譜峰），對模型變量投影 （VIP）參數(shù)進行分析，VIP＞1時表明影響顯著。各變量VIP得分圖 （圖4）表明，變量對分類的影響依次為Peak1＞Peak14＞Peak5＞Peak8＞Peak13＞Peak2＞Peak9＞Peak11＞Peak17＞Peak15＞Peak6＞Peak16＞Peak10＞Peak4＞Peak12＞Peak3＞Peak7。然后，將VIP大于1的11個峰（Peak1、Peak2、Peak5、Peak6、Peak8、Peak9、Peak11、Peak13、Peak14、Peak15、Peak17）作為分類標志物。

圖2 訓練集樣本的PLS-DA得分圖及置換檢驗圖Fig.2 PLS-DA score p lot and permutation test p lot of samples in training set

4 討論

圖3 訓練集與驗證集樣本的PLS-DA得分圖及置換檢驗圖Fig.3 PLS-DA score p lot and permu tation test p lot of sam ples in training set and test set

圖4 各變量（色譜峰）VIP得分圖Fig.4 VIP score p lot of variables（chromatographic peaks）

4.1 色譜條件的選擇 采用二極管陣列檢測器考察200～400 nm處不同檢測波長的圖譜。結(jié)果表明，350 nm處的圖譜清晰、特征性強、色譜信息豐富，考慮到雪菊中的主要成分為酚酸類和黃酮類化合物，因此選擇350 nm作為指紋圖譜的檢測波長。

另外，還考察了甲醇-磷酸、乙腈-醋酸、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液等多種流動相系統(tǒng)。結(jié)果表明，乙腈-磷酸水溶液流動相系統(tǒng)具有較好的分離效果，在此條件下峰形較好，基線較平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析。

4.2 提取方法考察 本實驗考察了回流法、超聲提取法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取法比水浴回流提取法的收率高，而且操作方便。同時，對提取溶劑100%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯進行考察，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取色譜峰的數(shù)量明顯減少，而其他溶劑提取效果大致相當，考慮到乙醇毒性較小，故采用70%乙醇溶劑提取。

4.3 所建立指紋圖譜與雪菊質(zhì)量關(guān)聯(lián)性及應用意義 本實驗用指紋圖譜表征結(jié)合PLS-DA分析思路來闡釋藥物質(zhì)量，結(jié)果指認出綠原酸、木犀草素，它們具有顯著的生物活性，與雪菊的質(zhì)量密切相關(guān)，如綠原酸 （peak2）具有抗菌消炎、保肝利膽等作用；木犀草素 （peak16）具有消炎、抗腫瘤等作用。而且，還將指紋圖譜和PLS-DA統(tǒng)計學方法結(jié)合，從而實現(xiàn)不同地區(qū)雪菊的區(qū)分，并得到分類標志物Peak1、Peak2、Peak5、Peak6、Peak8、Peak9、 Peak11、 Peak13、 Peak14、 Peak15、Peak17，這為雪菊產(chǎn)地的鑒別提供了一種新方法，也為深層次的相關(guān)質(zhì)量評價提供依據(jù)。

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Quality evaluation of Coreopsis tinctoria in Xinjiang and Yunnan based on HPLC fingerprint and PLS-DA

HUANG Han， ZENG Ling-jie*， FENG Hong-yao， MO Yun-cai， GUO Yu-mei， LIAO Su-xi

（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 51OOO6，China）

AIM To evaluate the quality of Coreopsis tinctoria in Xinjiang and Yunnan by HPLC fingerprint and partial least-squares discriminant analysis（PLS-DA）.M ETHODS The analysis of C.tinctoria extractwas performed on Agilent TC-C18column（4.6 mm×250 mm，5μm），mobile phase was acetonitrile-0.1%H3PO4aqueous solution with gradient elution，flow rate was1.0 mL/min，column temperature wasmaintained at30℃，and detection wavelength was set at 254 nm.RESULTS The similarities of eleven samples in training set were more than 0.983.PLS-DA could significantly distinguish the samples from Xinjiang and Yunnan.Moreover，eleven constituents（chromatographic peaks）were taken as classification markers.CONCLUSION Thismethod is simple，stable and feasible，which can be used for the quality control and classification of Coreopsis tinctoria.

Coreopsis tinctoria；quality evulation；classification；HPLC fingerprint；PLS-DA

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2710-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.029

2015-04-28

廣東藥學院中青年骨干教師培養(yǎng)項目 （2012JDX01）

黃 涵 （1989—），男，碩士，從事生藥活性成分與質(zhì)量評價研究。Tel：15876571918，E-mail：316307565@qq.com

*通信作者：曾令杰（1970—），男，博士，教授，從事中藥質(zhì)量評價研究。E-mail：zlj334477@aliyun.com

雪菊提取液分析采用Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長350 nm。結(jié)果 11批訓練集樣品的相似度均大于0.983，PLS-DA法可顯著區(qū)分新疆、云南兩個產(chǎn)地的雪菊，有11個成分 （色譜峰）為分類標志物。結(jié)論 該方法簡便、穩(wěn)定、可行，可用于雪菊的質(zhì)量評價及分類。