嚴(yán)建業(yè)， 王元清， 黃 丹， 韓 彬， 張 陳， 向 榮， 孫 琴， 夏新華*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208；2.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)與工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410004；3.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長(zhǎng)沙410208；4.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006；5.暨南大學(xué)藥學(xué)院2014級(jí)研究生，廣東廣州510632）

HPLC-DAD測(cè)定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)

嚴(yán)建業(yè)1， 王元清2， 黃 丹3， 韓 彬4*， 張 陳5， 向 榮2， 孫 琴2， 夏新華1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208；2.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)與工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410004；3.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長(zhǎng)沙410208；4.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006；5.暨南大學(xué)藥學(xué)院2014級(jí)研究生，廣東廣州510632）

目的 測(cè)定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù) （lg Papp）。方法 采用高效液相色譜法測(cè)定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在不同pH緩沖溶液中的平衡溶解度；采用搖瓶法結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定其在正辛醇-水及緩沖鹽溶液中的表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果 虎杖苷、白藜蘆醇均在pH為6.8的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大，大黃素在pH為6.5的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大；虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在正辛醇飽和的水中l(wèi)g Papp值分別為0.98、2.69、0.99，在不同pH的磷酸鹽緩沖液中，虎杖苷、白藜蘆醇與大黃素的油水分配系數(shù)范圍分別為0.84～1.01、2.34～2.89、0.97～1.27。結(jié)論 在胃腸道生理?xiàng)l件下，虎杖苷與大黃素的吸收較好，白黎蘆醇的吸收較差；從溶解性能看，大黃素的溶解性能較差，可改善其溶解性能進(jìn)一步提高其生物利用度。

虎杖苷；白藜蘆醇；大黃素；平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)；HPLC-DAD

虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素為虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.中主要藥效成分，具有抗炎、抗氧化［1-2］、抗癌、抗腫瘤［3-4］、抑制血小板凝聚［5-6］、調(diào)節(jié)脂蛋白代謝［7］等功效，其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 虎杖苷 （A）、白藜蘆醇 （B）和大黃素 （C）的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of polydatin（A），resveratrol（B），and emodin（C）

一直以來，虎杖中的化學(xué)成分、藥理作用、臨床療效等方面研究都是國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究的重點(diǎn)，而且目前關(guān)于這3種成分的藥動(dòng)學(xué)及其理化性質(zhì)方面均有相關(guān)研究報(bào)道［8-10］，但虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素這3種成分的油水分配系數(shù)等理化常數(shù)暫無(wú)相關(guān)報(bào)道。由于藥物的理化參數(shù)與其在生物體內(nèi)膜滲透性密切相關(guān)，影響藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征與指導(dǎo)劑型設(shè)計(jì)，故為進(jìn)一步開發(fā)虎杖的藥用價(jià)值，指導(dǎo)其合理用藥，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的表觀油水分配系數(shù)及平衡溶解度，以期為虎杖中這3種成分的吸收代謝與新劑型的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀 （美國(guó)安捷倫公司）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；SHY-2 S旋轉(zhuǎn)水浴恒溫振蕩器 （江蘇省金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）；T-214電子分析天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

虎杖苷 （批號(hào)131121，純度＞98%）、白藜蘆醇 （批號(hào)131021，純度＞98%）、大黃素 （批號(hào)130410，純度＞98%）均購(gòu)于成都普菲德生物科技有限公司；乙腈 （色譜純，美國(guó)Tedia公司）；甲醇 （色譜純，美國(guó)Tedia公司）；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 不同pH磷酸緩沖溶液的配制 按 《中國(guó)藥典》2010年版附錄［11］配制pH分別為2.0、2.5、5.0、5.8、6.5、6.8、7.8系列的磷酸鹽緩沖液；另取氯化鈉1 g，量取濃鹽酸3.5 mL置于500 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻配制成pH 1.2的緩沖液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對(duì)照品適量，精密稱定置于棕色量瓶中，分別加甲醇超聲溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為61、1.17、10.3μg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.2 虎杖苷、白藜蘆醇與大黃素的測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)［12］Agligent TC-C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6mm）；體積流量0.9 mL/min；進(jìn)樣量10μL；柱溫30℃；流動(dòng)相與檢測(cè)波長(zhǎng)見表1。色譜圖見圖2。

表1 各化合物色譜條件Tab.1 HPLC conditions for the components

2.2.2 線性關(guān)系的考察 取虎杖苷對(duì)照品 （61 μg/mL）、白藜蘆醇對(duì)照品（1.17μg/mL）、大黃素對(duì)照品 （10.3μg/mL）溶液均進(jìn)樣2、4、6、8、10、12μL，按 “2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，以各成分峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得虎杖苷的回歸方程為Y=3.7595X+747.27，r=0.999 7；白藜蘆醇的回歸方程為Y=9.235X+0.84，r=0.999 6；大黃素的回歸方程為Y=3.915 5X-1.98，r=0.998 1。結(jié)果表明，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素分別在122～732 ng、2.34～14.04 ng、20.6～123.6 ng范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖2 對(duì)照品 （A）與樣品 （B）的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of reference substances（A）and sam p les（B）

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對(duì)照品溶液 （質(zhì)量濃度分別為61、1.17、10.3μg/mL）各10μL，按照 “2.2.1”項(xiàng)的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，計(jì)算RSD，其RSD分別為1.63%、1.85%、1.79%，表明儀器的精密度良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的虎杖苷樣品、白藜蘆醇樣品、大黃素樣品溶液2.0 mL，各6份，分別精密加入與樣品中成分含有量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品，制成供試品溶液，按照 “2.2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其平均回收率分別為99.3%、98.1%、98.2%，RSD分別為 1.4%、1.3%、1.3%，表明方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 平衡溶解度的測(cè)定 分別取過量的虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對(duì)照品置于10 mL試管中，加pH為7.8、6.8、6.5、5.8、5.0、2.5、2.0、1.2的磷酸鹽緩沖液各2 mL，將試管放入恒溫振蕩器中，控制溫度37℃，100 r/min振搖24 h，4 000 r/min離心10 min。取上清液分別適當(dāng)稀釋后，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在不同pH的緩沖溶液中的量，并計(jì)算其在不同緩沖溶液介質(zhì)中的平衡溶解度。結(jié)果見圖3。

由圖3可知，虎杖苷、白藜蘆醇均在pH為6.8的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大，隨著pH增大，其溶解度的整體變化趨勢(shì)是先增大再減小，然后又增大再減小。大黃素在pH為6.5的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大，該成分的溶解度受pH敏感，在pH 5.0與pH 7.8時(shí)的溶解度接近，在pH 5.8與pH 1.2時(shí)的溶解度接近。從溶解度絕對(duì)數(shù)值來看，虎杖苷＞白黎蘆醇＞大黃素，表明虎杖苷在各緩沖溶液中的溶解性能強(qiáng)于白黎蘆醇，白黎蘆醇強(qiáng)于大

黃素。

圖3 虎杖苷、白藜蘆醇與大黃素在不同pH的磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度Fig.3 Equilibrium solubilities of polydatin，resveratrol and emodin in phosphate buffer solutions of different pH values

2.4 油水分配系數(shù)的測(cè)定 取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于25 mL棕色量瓶中，加水飽和的正辛醇溶液超聲溶解，定容至刻度，搖勻，分別制成質(zhì)量濃度為 0.58、0.424、0.252 mg/m L的供試品貯備液，備用。分別精密吸取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的水飽和正辛醇溶液2 mL，分別置于具塞試管中，分別加入2 mL正辛醇飽和水及不同pH的磷酸鹽緩沖液，將試管放入恒溫振蕩器中，控制溫度37℃，100 r/min振搖24 h。取下層水相4 000 r/min離心10 min，進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素質(zhì)量濃度，并按下式計(jì)算其表觀油水分配系數(shù)。

其中Papp為表觀油水分配系數(shù)，C1為藥物的總質(zhì)量濃度 （μg/mL），C0為藥物分配平衡后在油相中所測(cè)得的質(zhì)量濃度，Cw為藥物分配平衡時(shí)在水相中測(cè)得的質(zhì)量濃度。測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 虎杖苷、白藜蘆醇與大黃素的油水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果Tab.2 N-octanol/w ater partition coefficients of polydatin，resveratrol and emodin in different solutions

由表2可知，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在正辛醇飽和的水溶液中l(wèi)g Papp值分別為0.98、2.69、0.99；虎杖苷與白藜蘆醇在pH 1.2～2.5的緩沖溶液范圍內(nèi)lg Papp值隨pH的增大而增加，在pH 5.8～6.8時(shí)lg Papp值變化不明顯；虎杖苷在各溶液中的lg Papp值為1左右，白藜蘆醇在各溶液中的lg Papp值均大于2；大黃素在各溶液中的lg Papp值小于1.5。

3 討論

胃腸道不同部位具有不同的pH，如胃的pH為1.0～3.0，十二指腸的pH為4.0～6.0，空腸的pH為6.0～7.0，回腸的pH為7.0，結(jié)腸的pH為 8.0［12］。本研究所設(shè)計(jì)的緩沖溶液pH涵蓋了胃腸道的所有pH范圍，因而可模擬體內(nèi)環(huán)境研究其理化性質(zhì)。從平衡溶解度結(jié)果可知，虎杖苷在pH 2.0與pH 6.8時(shí)具有較高的溶解度，可能是這兩個(gè)酸性條件不利于虎杖苷的水解而提高了其溶解度；同時(shí)也表明虎杖苷在胃腸道中有較好的溶解度，有利于吸收。白藜蘆醇在pH為6.8、大黃素在pH為6.5的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大，表明這兩個(gè)化合物在空腸中的溶解度較大。從總的平衡溶解度測(cè)定結(jié)果來看，虎杖苷的溶解性大于白黎蘆醇，是由于白黎蘆醇為虎杖苷的苷元，因而脂溶性較虎杖苷強(qiáng)。大黃素在各緩沖溶液中的平衡溶解度均較小，表明大黃素具有較強(qiáng)的脂溶性；另外，大黃素為多羥基的蒽醌類化合物，具有一定的酸性，因而在強(qiáng)酸性溶液中不易成鹽而溶解度較低。

藥物油水分配系數(shù)的測(cè)定，可模擬其在生物體內(nèi)水相和生物相之間的分配情況，從而預(yù)測(cè)其在體內(nèi)不同部位的吸收性能。表觀油水分配系數(shù) （P）值較大或具有一定脂溶性的藥物，其生物膜滲透性較高，有利于體內(nèi)藥物的吸收［13］。藥物的lg P對(duì)于藥物在胃腸道吸收速度和程度有較大的影響，其最佳log P值在-1＜log P＜2，過低時(shí)（log＜-2）的化合物未能穿過脂質(zhì)膜；過高時(shí) （log P＞3）則因脂溶性過強(qiáng)而很難從細(xì)胞另一側(cè)的膜釋放出來進(jìn)入附近的血管或淋巴管［13］?；⒄溶盏挠退峙湎禂?shù)在0.84～1.01之間，lg Papp均大于0，可預(yù)測(cè)在此pH條件下虎杖苷在胃腸道各部位均有較好的吸收；白藜蘆醇的油水分配系數(shù)在2.34～2.89之間，lg Papp均大于2，可知白藜蘆醇的親脂性過強(qiáng)，進(jìn)而預(yù)示其很難從細(xì)胞的另一側(cè)釋放出來而生物利用度較低，這與文獻(xiàn)報(bào)道其具有較低的生物利用度一致［14］；大黃素的油水分配系數(shù)在0.97～1.27之間，均小于2，可見大黃素在胃腸道有較大的吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道相同［15］。

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在不同pH磷酸鹽緩沖液中表觀油水分配系數(shù)及平衡溶解度，為預(yù)測(cè)這3種成分在胃腸道不同pH梯度的吸收情況提供參考，同時(shí)也可為虎杖的新劑型開發(fā)及虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考價(jià)值。

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Determ ination of equilibrium solubility and n-octanol/water partition coefficient of polydatin，resveratrol and emodin by HPLC-DAD

YAN Jian-ye1， WANG Yuan-qing2， HUANG Dan3， HAN Bin4*， ZHANG Chen5， XIANG Rong2，SUN Qin2， XIA Xin-hua1*

（1.Key Lab for Modernization of Materia Medica，Schoolof Pharmacy，Hunan University of ChineseMedicine，Changsha 41O2O8，China；2.Lab of Biotechnology and Engineering，College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 41OOO4，China；3. Province&State Key Laboratory Breeding Base for Chinese Powdered Medicineand Medicine Innovation in Hunan，Hunan University of ChineseMedicine，Changsha，41OO28，China；4.Guangdong Pharmaceutical College，Guangzhou，51OOO6，China；5.Graduate Studentof Classof2O14，School of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou，51O632，China）

AIM To determine the equilibrium solubility of polydatin，resveratrol and emodin in different solvents and their n-octanol/water partition coefficients.METHODS The equilibrium solubilities of polydatin，resveratrol and emodin in solutionswere determined through HPLC-DAD analysis，and their n-octanol/water partition coefficients weremeasured by shaking flask combined with HPLC-DAD.RESULTS The equilibrium solubilities of polydatin and resveratrolwere found in theirmaximal values at pH 6.8，while that of emodin was at pH 6.5.the

polydatin；resveratrol；emodin；equilibrium solubility；n-octanol/water partition coefficient；HPLC-DAD

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2628-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.012

2015-03-16

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （81173194）；湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目資助 （湘科計(jì)字 ［2013］83號(hào)）；湖南省高校 “中藥新藥創(chuàng)制與資源綜合持續(xù)利用”科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助 （湘教通 ［2010］212號(hào)）；湖南省 “中藥學(xué)”重點(diǎn)學(xué)科資助（ZY201401）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 （201410538015）；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目 （2014194）；中南林業(yè)科技大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目 （201457）

嚴(yán)建業(yè) （1975—），男，博士，副教授，從事中藥藥劑的教學(xué)與科研。Tel：（0731）88458231，E-mail：yanjianye201@ 126.com

*通信作者：韓 彬，男，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：（0731）39352182，E-mail：hblz99@2lcn.com夏新華，男，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：（0731）88458227，E-mail：xiaxinhua001@163.com

scopes of n-octanol/water partition coefficients of polydatin，resveratrol and emodin in different pH buffer solutions were within the ranges of 0.84-1.01，2.34-2.89，and 0.97-1.27，respectively.And their lg Pappin n-octanol/water solventwere shown to be 0.98，2.69，and 0.99，respectively.CONCLUSION Unlike resveratrol，polydatin and emodin have good absorption under physiological conditions in the gastrointestines.