孟 元，張玉婷，吳 敏，郭慶勇，張 楊，巴音查汗

（1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

新疆革蜱源性牛無(wú)漿體的PCR檢測(cè)

孟 元1，張玉婷2，吳 敏1，郭慶勇2，張 楊2，巴音查汗2

（1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

為了解新疆部分地區(qū)優(yōu)勢(shì)媒介革蜱類(lèi)傳播牛無(wú)漿體的狀況，隨機(jī)采集了吐魯番、巴州等牛場(chǎng)和放牧牛身上寄生的革蜱（N=140只），以16S rRNA基因?yàn)榘袠?biāo)分別設(shè)計(jì)了無(wú)漿體屬通用引物（EE1/EE2）和牛無(wú)漿體特異性引物（AB1f/AB1r），運(yùn)用嵌套式PCR方法擴(kuò)增其全基因組DNA。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在140只革蜱全基因組DNA中，擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的13只，其牛無(wú)漿體的陽(yáng)性率為9.3%（13/140），這結(jié)果被陽(yáng)性革蜱同一個(gè)群的革蜱動(dòng)物傳播試驗(yàn)所驗(yàn)證。經(jīng)陽(yáng)性病原DNA的克隆測(cè)序、比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)該牛無(wú)漿體病原DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的西藏株（AF414399）和福建株（DQ324547）相似，其同源性均為99%。試驗(yàn)表明，新疆牛無(wú)漿體可能被當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)媒介革蜱所攜帶和傳播，該參數(shù)可為地方蜱傳無(wú)漿體病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

革蜱源性；牛無(wú)漿體；PCR；檢測(cè)

無(wú)漿體?。ˋnaplasmosis）也稱(chēng)邊蟲(chóng)病，是由無(wú)漿體（Anaplasma）經(jīng)蜱傳播而引起牛、羊、鹿等家畜的一種傳染性血液原蟲(chóng)病[1-3]。1910年在北非首次發(fā)現(xiàn)了由邊緣無(wú)漿體（Anaplasma marginale）引起牛無(wú)漿體病，后來(lái)發(fā)現(xiàn)該病廣泛分布于世界各地[4]。該病引起宿主動(dòng)物體重下降，流產(chǎn)，產(chǎn)奶量下降，嚴(yán)重者可以致死，牛死亡率可達(dá)80%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。據(jù)報(bào)道，牛無(wú)漿體病是蜱傳播中嚴(yán)重阻礙養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的、分布最廣的一種[6]，鑒于此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須通報(bào)的疫病[7]。在新疆境內(nèi)分布的媒介蜱蟲(chóng)種類(lèi)多、分布廣，草地資源豐富，宿主動(dòng)物-牛幾乎放牧為主，故宿主牛很容易遭受被媒介蜱的侵襲，發(fā)生蜱傳牛無(wú)漿體病。目前，對(duì)于無(wú)漿體病的診斷，可以根據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀來(lái)做出初步判斷，然后通過(guò)姬姆薩染色血涂片法發(fā)現(xiàn)無(wú)漿體來(lái)進(jìn)行確診。但血涂片染色法在感染率很低或在感染早期時(shí)很難在顯微鏡下檢查出病原，而且操作熟練程度將直接影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，需要分子生物學(xué)的方法來(lái)快速、準(zhǔn)確的診斷無(wú)漿體病。本研究運(yùn)用嵌套式PCR方法檢測(cè)

革蜱唾液腺內(nèi)攜帶的牛無(wú)漿體病原，為新疆草原牛無(wú)漿體病的流行病學(xué)調(diào)查和綜合防治提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Premix Ex Taq、DNAMarker 2 000、pMD18-T載體，均購(gòu)自TaKaRa公司；全血基因組提取試劑盒，購(gòu)自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒，購(gòu)自Axygen公司；DH5α，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DNA C1000 Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀Bio-Rad公司產(chǎn)品，DYY-Ⅱ型電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品，JS-680全自動(dòng)凝膠成像分析儀為上海培清科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 擴(kuò)增引物 第1輪擴(kuò)增引物EE1/EE2[8]可擴(kuò)增無(wú)漿體16S rRNA基因，具有屬特異性，預(yù)擴(kuò)增的目的片段為1 430 bp，上游引物EE1：5′-TCCT?GGCTCAGAACGAACGCTGGC-3′，下游引物EE2：5′-AGTCACTGACCCAACCTTAAATGGCTG-3′；第2輪擴(kuò)增引物AB1f/AB1r[9]可以特異性擴(kuò)增牛無(wú)漿體16S rRNA基因，預(yù)擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為551 bp，序列如下：上游引物AB1f：5′-CTCGTAGCTT?GCTATGAGAAC-3′，下游引物AB1r：5′-TCTCCCG?GACTCCAGTCTG-3′。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3 蜱蟲(chóng)攜帶無(wú)漿體基因組DNA的提取 蜱蟲(chóng)樣品有新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)合作項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)采集于吐魯番、巴州等地養(yǎng)殖牛場(chǎng)和放牧牛體表，經(jīng)鑒定到革蜱屬（N=140只，包括銀盾革蜱和草原革蜱，鑒定結(jié)果省略）后，按規(guī)定運(yùn)輸送來(lái)浙大生科院實(shí)驗(yàn)室待檢。將單個(gè)蜱蟲(chóng)樣品置于大平皿中用蒸餾水刷洗干凈后，在研缽中研磨充分后，加入200μL PBS（1×）緩沖液，20μL Proteinase K消化液，混勻，與56℃恒溫水浴鍋消化30min后，用DNA提取試劑盒進(jìn)行革蜱DNA，DNA分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蜱源性牛無(wú)漿體的PCR檢測(cè) 根據(jù)Liu等[10]使用的PCR的方法對(duì)上述蜱蟲(chóng)樣品進(jìn)行檢測(cè)。巢式PCR的第一輪反應(yīng)體系為20μL：Premix Ex Taq 10 μL，EE1（10μmol/L）2.0μL，EE2（10μmol/L）2.0μL，DNA模板2.0μL，ddH2O 4.0μL。反應(yīng)條件為94℃3min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。將第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為第2輪反應(yīng)的模板，PCR反應(yīng)體系為20μL：Premix Ex Taq10μL，AB1f（10μmol/L）2.0μL，AB1r（10μmol/L）2.0μL，第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物1.0μL，ddH2O 5.0μL。反應(yīng)條件為94℃3min；94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，根據(jù)電泳后PCR產(chǎn)物的位置確定是否為所擴(kuò)增的目的片段。

1.5 PCR產(chǎn)物的連接、克隆及測(cè)序鑒定 為鑒定該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取PCR陽(yáng)性產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化的條帶，然后進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為10μL，包括：純化的產(chǎn)物4μL，SolutionⅠ5μL，pMD18-TVector 1μL，充分混勻后16℃水浴連接過(guò)夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5-α細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定后送英駿（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 16S rRNA基因序列同源性分析 將獲得的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Genetyx（version7）和BLAST在線服務(wù)分析基因的同源性分析。從NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相關(guān)物種的16S rRNA基因序列。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 蜱蟲(chóng)基因組的提取 將提取的蜱蟲(chóng)DNA 5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，均得到清晰的電泳條帶，由此驗(yàn)證蜱DNA提取成功。

2.2 蜱源性牛無(wú)漿體PCR檢測(cè)結(jié)果 以提取的蜱蟲(chóng)基因組DNA為模板，采用巢式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，第1輪EE1/EE2擴(kuò)增結(jié)果在1 500 bp附近有特異性的陽(yáng)性條帶（見(jiàn)圖1），第2輪AB1f/AB1r擴(kuò)增結(jié)果在500 bp附近有特異性的陽(yáng)性條帶（見(jiàn)圖2），與預(yù)測(cè)的目的的片段大小一致。試驗(yàn)表明，新疆吐魯番和巴州部分地區(qū)分布的革蜱類(lèi)攜帶牛無(wú)漿體，其感染率為9.3%（13/140）。該結(jié)果被同一類(lèi)革蜱的動(dòng)物傳播試驗(yàn)驗(yàn)證（該文省略此結(jié)果）。

圖1 無(wú)漿體屬通用引物EE1/EE2PCR檢測(cè)M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：吐魯番樣品的疑似樣品PCR產(chǎn)物；3：陰性對(duì)照

圖2 牛無(wú)漿體特異性引物AB1f/AB1rPCR檢測(cè)M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7：吐魯番部分樣品的PCR產(chǎn)物；8：陰性對(duì)照

表1 不同地區(qū)牛體表革蜱攜帶牛無(wú)漿體的感染率

2.3 16S rRNA基因的克隆、測(cè)序 在巢式PCR所檢測(cè)出的13份陽(yáng)性樣品進(jìn)行16S rRNA基因的克隆和測(cè)序，將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液送往英駿（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用NCBI網(wǎng)站的BLAST將測(cè)序序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，與西藏[11]株（基因登錄號(hào)：AF414399）和福建株（基因登錄號(hào)：DQ324547）的無(wú)漿體相比，同源性均為99%。通過(guò)牛無(wú)漿體特異性引物檢測(cè)，結(jié)果顯示也為陽(yáng)性，即采自吐魯番等地的部分革蜱攜帶牛無(wú)漿體病原，表明該巢式PCR的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 討論與小結(jié)

牛無(wú)漿體主要感染動(dòng)物的單核細(xì)胞，可通過(guò)長(zhǎng)角血蜱（Haemaphysalis longicornis）和巨刺血蜱（H. megaspinosa）進(jìn)行傳播[12-14]。我國(guó)對(duì)于牛無(wú)漿體的流行病學(xué)資料稀少，目前僅有周作勇等[15]從分子水平上證實(shí)了重慶市存在牛無(wú)漿體及上海獸醫(yī)研究所Liu等[10]對(duì)浙江、湖北、河南、貴州四省山羊中無(wú)漿體的流行狀況進(jìn)行了調(diào)查，遲慶安[7]運(yùn)用分子生物學(xué)的方法對(duì)四川、重慶、云南、貴州、廣西、湖南、廣東等南方地區(qū)牛無(wú)漿體病的流行情況進(jìn)行了調(diào)查。有關(guān)新疆牛無(wú)漿體病的流行病學(xué)資料幾乎空白，為彌補(bǔ)我國(guó)西域區(qū)域牛無(wú)漿體流行病學(xué)資料，筆者結(jié)合浙大-新疆農(nóng)大合作項(xiàng)目，對(duì)新疆吐魯番、巴州等地區(qū)的蜱源性牛無(wú)漿體病原進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)合之前的有關(guān)蜱傳病研究表明，牛無(wú)漿體常常與牛梨形蟲(chóng)（俗稱(chēng)牛焦蟲(chóng)）混合感染，在我國(guó)新疆部分地區(qū)廣泛流行，應(yīng)引起相關(guān)部門(mén)的高度重視。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采自新疆吐魯番的部分革蜱（包括銀盾革蜱和草原革蜱）攜帶牛無(wú)漿體，其陽(yáng)性率達(dá)2.8%，而巴州地區(qū)的部分革蜱攜帶牛無(wú)漿體的陽(yáng)性率可達(dá)34.4%。這可能由于巴州牧業(yè)縣的牛群自然放牧為主，與革蜱接觸頻繁有關(guān)，導(dǎo)致牛無(wú)漿體的感染率偏高，建議加強(qiáng)防范。有關(guān)地方媒介蜱攜帶病原種類(lèi)及其生物學(xué)特性與宿主動(dòng)物關(guān)系等待進(jìn)一步研究，這次試驗(yàn)研究為當(dāng)?shù)氐尿鐐骷膊〉木C合防治奠定基礎(chǔ)。

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PCR Detection of Dermacentor-borne Anaplasma bovis in Xinjiang

MENG Yuan1，ZHANG Yu-ting2，WUMin1，GUOQing-yong2，ZHANG Yang2，Bayinchahan2
（1.College of life Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；2.College of VeterinaryMedicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China）

In order to investigate whether Anaplasma bovis was spread mainly by Dermacentor in parts of Xinjiang，one hun?dred and forty ticks from cattleswere collected in Turpan，Bazhou，and other epidem ic areas.The universal primers（EE1/EE2）and gene specific primers（AB1f/AB1r）were designed to target the 16S rRNA of Anaplasma bovis and nested PCR was applied to am?plify its full genomic DNA.The results showed that 13 positive bandswere observed in 140 genome DNA samples from Dermacen?tor，and the positive rate of Anaplasma bovis was 9.3%（13/140），which were verified by Dermacentor spread pathogenic on animals of experiments from the same group of positive Dermacentor.DNA-positive pathogens were cloned and sequenced.The results showed that the DNA sequence of Anaplasma bovis was similarwith Tibet strain（AF414399）and Fujian strain（DQ324547）in the database，and their homology were 99%.The study suggestes that Anaplasma bovis is inmainly in Dermacentor and transmissed by Dermacentor in Xinjiang，our data provides the basis for the prevention of tick-borne Anaplasma in Xinjiang.

Dermacentor-borne；Anaplasma bovis；PCR；detection

Bayinchahan

S852.74+6

A

0529-6005（2015）11-0036-03

2015-04-26

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（2013911061）

孟元（1991-），女，博士生，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究，E-mail：673177231@qq.com

巴音查汗，E-mail：bynch@hotmail.com