翟 凱，錢偉鋒，王天奇，邵曉冬，閆文朝，韓利方，呂超超

（1.河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000）

河南洛陽地區(qū)流產(chǎn)奶牛感染性病原的分子檢測

翟 凱1，錢偉鋒1，王天奇1，邵曉冬1，閆文朝1，韓利方1，呂超超2

（1.河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000）

為調(diào)查洛陽地區(qū)引起奶牛流產(chǎn)的主要病原，于2013年7月至2014年3月，收集該地區(qū)6個奶牛場（或小區(qū)）共42頭新鮮流產(chǎn)胎牛，及其母體的血液、陰道分泌物和鼻腔分泌物，計為42例樣本，采用PCR或RT-PCR方法對所采集樣本進行新孢子蟲、弓形蟲、胎兒三毛滴蟲、布魯菌、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）和牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）6種常見流產(chǎn)病原的核酸檢測。結(jié)果顯示，被檢樣本總感染率為42.9%（18/42），其中新孢子蟲感染率最高，為40.5%（17/42）；IBRV次之，為11.9%（5/42）；胎兒三毛滴蟲、布魯菌、弓形蟲和BVDV感染率分別為2.4%、2.4%、2.4%和0。14.3%（6/42）的被檢樣本存在混合感染，其中以新孢子蟲+IBRV混合感染為主（50%，3/6）。結(jié)合被檢流產(chǎn)奶牛的臨床特征及飼養(yǎng)管理等因素，推斷新孢子蟲是導致該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的最主要病原，本研究結(jié)果將為該地區(qū)有效防控奶牛流產(chǎn)提供科學依據(jù)。

奶牛；流產(chǎn)；病原；PCR；新孢子蟲

奶牛流產(chǎn)導致產(chǎn)犢間隔擴大，增加養(yǎng)牛的飼料成本，影響高產(chǎn)奶量的獲得和后備牛的擴充，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計，每個流產(chǎn)病例平均經(jīng)濟損失達640美元[1-2]。一般認為，牛場的年流產(chǎn)率在3%～5%為正?，F(xiàn)象，但據(jù)近年調(diào)查顯示，國內(nèi)奶牛流產(chǎn)率達10%～25%[1-3]。診斷分析流產(chǎn)原因，對預防和控制奶牛流產(chǎn)具有重要的意義。

引起妊娠母牛流產(chǎn)的原因可分為病原性因素和非病原性因素。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，病原性因素引起的奶牛流產(chǎn)最多達90%左右[2]，其中最常見

的相關病原有新孢子蟲（Neospora caninum）、弓形蟲（Toxoplasma gondii）、胎兒三毛滴蟲（Tritricho?monas foetus）、布魯菌（Brucella abortus）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectiousbovine rhinotracheitisvirus，IBRV）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea vi?rus，BVDV）等[1-2，4-5]。本實驗室于2013年7月對洛陽地區(qū)部分奶牛養(yǎng)殖場（小區(qū)）就奶牛流產(chǎn)情況進行了調(diào)查，奶牛流產(chǎn)率均在10%以上，個別養(yǎng)殖戶的奶牛流產(chǎn)率高達20%，但引起流產(chǎn)的原因尚不清楚。為調(diào)查洛陽地區(qū)引起奶牛流產(chǎn)的主要病原，本研究從該地區(qū)奶牛場（小區(qū)）采集流產(chǎn)胎牛及其母體的血液、鼻腔分泌物和陰道分泌物，通過PCR或RT-PCR方法檢測可能引起奶牛流產(chǎn)的6種病原，結(jié)合流產(chǎn)奶牛的臨床表現(xiàn)、養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理等方面因素，分析引起奶牛流產(chǎn)的主要病原，為該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的科學防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 于2013年7月至2014年3月期間，采集洛陽地區(qū)6個奶牛養(yǎng)殖小區(qū)42頭新鮮流產(chǎn)胎牛，及其對應母體的血液、鼻腔分泌物和陰道分泌物，計為42份樣本。36個流產(chǎn)病例為妊娠5～7個月流產(chǎn)，流產(chǎn)母牛均未見其他明顯的臨床癥狀；其余6例為妊娠5個月內(nèi)流產(chǎn)。

所采集流產(chǎn)胎牛的心、腦組織用于新孢子蟲（N.caninum）和弓形蟲（T.gondii）的檢測，肝、脾、肺、腎用于IBRV、BVDV和布魯菌（B.abortus）的檢測，肺和皺胃內(nèi)容物用于胎兒三毛滴蟲（T.foetus）的檢測；母體鼻腔分泌物用于IBRV的檢測，陰道分泌物用于胎兒三毛滴蟲（T.foetus）、布魯菌（B. abortus）和BVDV的檢測；全血用于除胎兒三毛滴蟲外上述5種病原的檢測。

1.2 主要試劑 組織/血液/細胞DNA提取試劑盒為北京莊盟國際生物基因科技有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑、2×Easy Taq PCR SuperMix、DNA Marker DL-2 000、pEASY-T1 Simple克隆載體、DH5α感受態(tài)細胞、DNA凝膠回收純化試劑盒等為北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.3 核酸提取和反轉(zhuǎn)錄 待測樣本的DNA和RNA提取、RNA的反轉(zhuǎn)錄分別參照試劑盒說明書進行。

1.4 PCR檢測 弓形蟲的巢氏PCR擴增引物及反應條件參考ContiniC.等[6]的報道；新孢子蟲、胎兒三毛滴蟲、IBRV、BVDV和布魯菌的PCR擴增引物及程序參考Yang N.等[4]的報道。PCR擴增所針對的6種病原基因、目標片段大小及引物序列見表1。隨機選取部分PCR陽性產(chǎn)物，與pEASYT1 Simple克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)藍白斑篩選并鑒定后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種病原的PCR擴增情況 除BVDV外，其余5種病原均有檢出（圖1～圖5）。測序及序列比對結(jié)果顯示，擴增的布魯菌16sRNA基因、IBRV gB基因、弓形蟲B1基因和胎兒三毛滴蟲rRNA基因的序列分別與GeneBank中相應病原序列（KC790986、

KF734618、HC607827和KJ439572）的核苷酸相似性均為100%。測得的3株新孢子蟲Nc5基因序列之間有4個堿基存在差異，相似性為99%。與GenBank中北京株新孢子蟲（JN106449、JN106453、JN106452）和國外報道的新孢子蟲序列（EU073600、AY911515、AY665722）的相似性為98%～99%。

表1 6種病原擴增的引物

圖1 流產(chǎn)胎牛腦和心臟中新孢子蟲Nc5基因的巢氏PCR擴增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標準；A1、A2：1頭流產(chǎn)胎牛的腦、心；B1、B2：另1頭流產(chǎn)胎牛的腦、心；+：陽性對照，-：陰性對照

圖2 1頭流產(chǎn)胎牛的肺、肝、脾、腎中IBRV gB基因PCR擴增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標準；1～4：流產(chǎn)胎牛的肺、肝、脾、腎；+：陽性對照；-：陰性對照

2.2 流產(chǎn)病例6種病原的檢出情況 42例樣本中有18例（42.9%）被檢出至少一種病原（表1）。其中，新孢子蟲感染率最高，為40.5%；其次為IBRV，為11.9%；胎兒三毛滴蟲、弓形蟲和布魯菌感染率均為2.4%，未檢出BVDV。同時感染2種或2種以上病原的樣本有6例，占被檢樣本總數(shù)的14.3%（6/42）。其中，新孢子蟲＋IBRV 3例，新孢子蟲＋胎兒三毛滴蟲、新孢子蟲＋弓形蟲、新孢子蟲＋布魯菌＋IBRV各1例。

圖3 流產(chǎn)胎牛肺組織中胎兒三毛滴蟲rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標準；1～4：4頭流產(chǎn)胎牛的肺；+：陽性對照；-：陰性對照

圖4 流產(chǎn)胎牛肺、肝、脾、腎中布魯菌16S rRNA基因的PCR擴增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標準；1～4：流產(chǎn)胎牛的肺、肝、脾、腎；+：陽性對照，-：陰性對照

圖5 流產(chǎn)母牛血液中弓形蟲B1基因的巢氏PCR擴增產(chǎn)物M：DNA分子質(zhì)量標準；1～6：6頭流產(chǎn)奶牛的血液；+：陽性對照；-：陰性對照

2.3 不同類型樣品的檢出情況 17頭新孢子蟲陽性的流產(chǎn)胎牛，有9例在其母體血液中檢出。5例IBRV陽性的流產(chǎn)胎牛，有2例在其母體的血液和鼻腔分泌物檢出，有1例僅在其母體的鼻腔分泌物中檢出。弓形蟲陽性病例僅見于1頭流產(chǎn)母牛，而在

其流產(chǎn)胎牛組織中未檢出，經(jīng)間接血凝試驗（IHA）檢測，該流產(chǎn)母牛血清中存在弓形蟲抗體，但抗體水平較低（1∶64）。布魯菌陽性的流產(chǎn)病例在其流產(chǎn)胎牛及其母體陰道分泌物中均被檢出，胎兒三毛滴蟲僅在1頭流產(chǎn)胎牛肺內(nèi)被檢出。

表2 流產(chǎn)奶牛42例樣本中6種病原的PCR檢測結(jié)果

3 討論

導致奶牛流產(chǎn)的原因極其復雜，除非病原因素外，有約30多種病原可引起奶牛的流產(chǎn)。流產(chǎn)奶牛通常無典型的示病性臨床癥狀，也難以通過流產(chǎn)胎兒組織的病理變化確定病因。常規(guī)實驗室診斷技術如病原分離培養(yǎng)、病理組織學檢查等技術，耗時耗力且靈敏度較低。PCR方法特異性強，敏感性高，且具有快速診斷的優(yōu)點，可彌補以上診斷方法的不足[7]。

本研究以引起奶牛流產(chǎn)的6種常見病原為檢測對象，結(jié)果檢出5種病原。其中新孢子蟲的陽性率最高，IBRV次之，布魯菌、弓形蟲、胎兒三毛滴蟲檢出率相對較低，表明新孢子蟲可能是引起洛陽地區(qū)奶牛流產(chǎn)的主要病原因素。Yang N.等[4]于2012年對北京地區(qū)流產(chǎn)胎牛進行9種病原的PCR檢測，結(jié)果IBRV和新孢子蟲的檢出率較高，分別是36.3%（29/ 80）和31.3%（25/80），而其他病原檢出率較低，與本調(diào)查檢測結(jié)果相似。然而，不同地區(qū)致奶牛流產(chǎn)的病原可能不同，如操國景等[2]2011年報道，北京某奶牛場新孢子蟲和牛病毒性腹瀉病毒抗體陽性率分別為83%和75%，二者是主要病原因素，而布魯菌、李氏桿菌和牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體均為陰性；王雙山[1]等2013年報道，河南安陽某規(guī)?；膛隽鳟a(chǎn)奶牛布魯菌、弓形蟲、新孢子蟲、衣原體抗體陽性率分別為28%、10%、8%和0，前3種病原可能是導致奶牛流產(chǎn)的主要致病因素。國內(nèi)關于流產(chǎn)奶牛感染胎兒三毛滴蟲的報道較少，Yang N.等[4]2012年報道，北京地區(qū)奶牛流產(chǎn)胎兒肺中胎兒三毛滴蟲的PCR檢出率為5%（4/80），在其中1頭流產(chǎn)母牛的陰道分泌物中檢出，高于本調(diào)查的檢出率（2.4%）。不同地區(qū)致奶牛流產(chǎn)的病原因素的差異性可能與區(qū)域內(nèi)奶牛引種來源、飼養(yǎng)管理方式等方面有關。

本研究結(jié)果顯示，流產(chǎn)胎牛新孢子蟲的檢出率高達40.5%（18/28），低于北京地區(qū)Yao L.等[8]2009年的報道（57.7%），但高于Yang N.等[4]2012年的報道（31.3%）。在18例被檢出流產(chǎn)相關病原的樣本中，有17例為新孢子蟲陽性。通過臨床調(diào)查得知，這17例新孢子蟲陽性的奶牛均在妊娠5～7個月出現(xiàn)流產(chǎn)，且未見其他明顯的臨床表現(xiàn)，與KiowaiM.等[9]報道的新孢子蟲陽性牛的平均流產(chǎn)時間為妊娠5～7個月相符。洛陽地區(qū)奶牛養(yǎng)殖多以小區(qū)形式存在，一個小區(qū)內(nèi)有多家養(yǎng)殖戶，每戶有單獨的牛舍、活動場和飼料庫。它們除共用一個通道進入擠奶房外，引種、飼養(yǎng)管理、疫病診斷及防制等均各自獨立。同時，這些奶牛養(yǎng)殖小區(qū)內(nèi)均有犬存在，犬在夜間均被放開自由活動，可自由進入牛舍、活動區(qū)和飼草存放區(qū)，其糞便中的卵囊可能會污染飼草及飲水。且多數(shù)畜主會把胎盤和流產(chǎn)的胎牛直接喂犬，從而使新孢子蟲在犬與奶牛之間循環(huán)傳播，這可能是流產(chǎn)胎牛新孢子蟲檢出率高的原因。根據(jù)Dubey JP.等[10]提出的奶牛感染新孢子蟲的風險因素，如牛場內(nèi)犬的存在、飼草飲水污染和缺乏管理等，可以推斷新孢子蟲是造成該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的主要病原。

IBRV的檢出率為11.9%（5/42），總體陽性率低于Yang N.等[4]2012年報道的北京地區(qū)流產(chǎn)胎牛36.3%的檢出率，亦低于石冬梅等[11]報道的河南省牛IBRV 59.29%的平均血清陽性率。結(jié)果雖然表明IBRV在洛陽地區(qū)流產(chǎn)奶牛相關病例中存在，但本研究所檢測的流產(chǎn)奶牛均未見厭食、發(fā)熱、咳嗽、呼吸加快和結(jié)膜炎等IBR特征性臨床癥狀，且在5頭IBRV陽性病例中，有4頭的流產(chǎn)胎牛混合感染新孢子蟲或布魯菌＋新孢子蟲，因此，IBRV可能不是該地區(qū)引起奶牛流產(chǎn)的主要病原。

本試驗通過對洛陽地區(qū)部分奶牛場（小區(qū)）的流產(chǎn)樣本進行6種常見病原的PCR檢測，結(jié)合流產(chǎn)奶牛的臨床特征、飼養(yǎng)管理等因素綜合分析，推斷新孢子蟲是引起該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的主要病原。研究結(jié)果將為今后該地區(qū)奶牛流產(chǎn)的防控提供科學依據(jù)。

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M olecule Detection of Infectious Pathogens in Abortion Dairy Cattle in Luoyang

ZHAIKai1，QIANWei-feng1，WANG Tian-qi1，SHAO Xiao-dong1，YANWen-chao1，HAN Li-fang1，LV Chao-chao2
（1.College of Animal Science and Technology，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；2.PuLike Biological Engineering Co.，Ltd，Luoyang 471000，China）

In order to investigate themain cause of abortions in dairy herds in Luoyang，a total of 42 clinical abortion cases in?cluding 42 fresh aborted fetuses and samples（blood，nasal secretions，and vaginal secretions）from the corresponding aborting dams in 6 dairy herdswere collected between July 2013 and March 2014.Six infectious pathogens Neospora caninum，Toxoplasma gon?dii，Tritrixhomonas foetus，Brucella abortus，infectious bovine rhinotracheitis virus（IBRV），and bovine viral diarrhea virus（BVDV）were exam ined by PCR or RT-PCR.Results from this study indicated that the total infection rate was 42.9%（18/42）.Ofwhich the infection rate of N.caninum was the highest（17/42，40.5%），followed by the rate of IBRV（5/42，11.9%）.The infection rates of T. foetus，B.abortus，T.gondii and BVDV were 2.4%，2.4%，2.4%and 0，respectively.Themixed infection ratewas 14.3%（6/42），of whichmixed infection by N.caninum and IBRV was common（3/6，50%）.Combined with the clinicalmanifestations of the aborting cows and management in these dairy herds，N.caninum was thought to be themost potential cause of abortions in dairy herds in Luoyang.This studywillprovide scientific basis for effective prevention and controlof abortion agents in dairy cows in the region.

dairy cow；abortion；pathogens；PCR；Neospora caninum

s：QIANWei-feng；WANG Tian-qi

S852.72+3

A

0529-6005（2015）11-0016-04

2014-08-25

河南科技大學博士科研啟動基金

翟凱（1989-），男，碩士生，研究方向為獸醫(yī)寄生蟲學，E-mail：1528562000@qq.com

錢偉鋒，E-mail：qw f2012@yeah.net；王天奇，E-mail：wtq@mail.haust.edu.cn