蘇丹萍，李 冰，，張顯浩，陳瑞愛，，蔡佳躍，賀東生，

（1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642；2.廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司，廣東 云浮 527400）

2012-2014年我國南方地區(qū)豬流行性腹瀉病毒遺傳進化分析

蘇丹萍1，李 冰1，2，張顯浩2，陳瑞愛1，2，蔡佳躍2，賀東生1，2

（1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642；2.廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司，廣東 云浮 527400）

為分析豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的遺傳變異情況，本試驗對2012-2014年我國南方地區(qū)7個省市17份PEDV陽性樣品的S基因主要的中和表位區(qū)（COE）序列進行了RT-PCR擴增、克隆和測序，并與國內(nèi)外的代表性毒株進行序列比對和遺傳進化分析，結果表明，本研究中的17株PEDV毒株COE中有16株屬于第Ⅰ大群，而GD/FSss/2014屬于第Ⅱ大群，所有COE的核苷酸和氨基酸同源性分別為92.9%～99.8%和88.6%～100%，它們與經(jīng)典毒株CV777的核苷酸和氨基酸同源性分別為93.3%～99.5%和90%～98.6%，與疫苗株CV777 Vaccine的核苷酸和氨基酸同源性分別為95%～97.1%和92.9%～97.9%。COE的氨基酸序列發(fā)生了不同程度的點突變，為PEDV遺傳進化分析和疫病防制提供了新的參考。

豬流行性腹瀉病毒；主要中和表位區(qū)；南部地區(qū)；遺傳進化

PEDV主要基因編碼4種結構蛋白：S基因編

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）

碼纖突蛋白（Spike，S）、E基因編碼小包膜蛋白（Envelop，E）、M基因編碼膜蛋白（Membrane，M）、N基因編碼核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）[4]。其中S蛋白位于病毒粒子表面，在病毒粒子與細胞表面受體結合、膜融合和誘導宿主產(chǎn)生中和抗體等方面發(fā)揮重要生物學作用[5]。Chang SH等根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）S基因的中和表位區(qū)鑒定出PEDV S基因的一個中和表位區(qū)（Core neu?tralizing epitope，COE，aa499-aa638）[6]。有研究表明，S基因在分析PEDV流行毒株的遺傳變異和流行情況中發(fā)揮重要作用，而對PEDV COE的變異分析更能反應病毒免疫原性的變化情況[7]。本試驗對我國南方地區(qū)2012-2014年采集并鑒定的17株PEDV的COE進行了克隆、測序，并對其遺傳變異情況進行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 采集2012-2014年間廣東、四川、浙江等7個省的不同的暴發(fā)嚴重腹瀉的疑似感染PEDV豬場的仔豬的小腸或糞便樣品，總共17份樣品。

1.2 試劑材料 總RNA抽提試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品，PrimerScriptOne Step RT-PCR Kit、pMD-19T克隆載體為TaKaRa（大連）公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。

1.3 樣品中PEDV的RT-PCR檢測 病料樣品經(jīng)處理后，提取其總RNA，具體操作按照AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit說明書進行。以抽提的RNA為模板，利用PrimerScript One Step RT-PCR Kit II進行RT-PCR檢測，確定PEDV陽性樣品。檢測和測序用引物和反應程序參照田野等文獻中的方法進行[8]。

1.4 PEDV COE的克隆與測序 以PEDV陽性RNA樣品為模板對COE序列進行RT-PCR擴增。凝膠回收PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，陽性重組菌株送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，將所測序列上傳GenBank序列庫。

1.5 遺傳進化分析 利用DNAStar和BioEdit軟件將17株PEDV COE測序結果進行序列比對；利用Clustalx1.8和MEGA 4.0對這17個序列與國內(nèi)外已發(fā)表的22株PEDV進行同源性比較（見表1），并進行遺傳進化分析。

2 結果

2.1 PEDV S基因COE序列分析 將RT-PCR擴增所得的17個PEDV COE進行測序分析，所有17個COE序列全長為420個核苷酸，編碼140個氨基酸。

表1 本試驗中所用到的序列

把17個COE與國內(nèi)外PEDV參考毒株進行同源性分析，本試驗中17個COE核苷酸序列之間的同源性為92.9%～99.8%，推導的氨基酸序列之間的同源性為88.6%～100%；與經(jīng)典毒株CV777株的核苷酸同源性為93.3%～99.5%，氨基酸的同源性為90%～98.6%；與CV777Vaccine株的核苷酸同源性為95%～

97.1%，氨基酸的同源性為92.9%～97.9%。與CV777 Vaccine株相比，17個COE氨基酸出現(xiàn)了以下一些主要的氨基酸點突變：L3→S3，A19→S19，T51→S51，K65→N65，G96→S96，G111→V111，Q135→E135；此外，其余個別毒株在5、22、23、25、29、68、69、80、93、101、107、110、114、122、123、137等點位發(fā)生氨基酸點突變，結果詳見圖1。

圖1 COE氨基酸序列比對

圖2 PEDV COE序列的遺傳進化樹

2.2 PEDV S基因COE序列遺傳進化分析 將所測得的17個毒株序列與國內(nèi)外已發(fā)表的23株PEDV的COE序列進行比較，并建立了遺傳進化樹。結果表明，39個COE可分為3個群：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其中有16個COE基因與BJ-2011-1、NPLPEDv、CV777 Vaccine、Attenuated DR13等屬于第Ⅰ群，GD/FSss/2014與CV777、DR13等屬于第Ⅱ群，KNU-0801、Chinju99屬于第Ⅲ群。

3 討論

2010年10月以來，PED已在全國各豬場普遍流行，并主要侵害7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬，發(fā)病率和死亡率高達60%～100%；該病夏季高溫時也有發(fā)生與流行，已無明顯的季節(jié)性，并且反復發(fā)作，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損害。2013年以來，美國也發(fā)生了類似的PED疫情，造成嚴重的經(jīng)濟損失[9]。

PEDV S基因編碼的S蛋白是該病毒的主要結構蛋白，在病毒感染宿主機體后介導中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要的生物學功能，在免疫反應中起重要作用。COE是S基因中能夠誘導產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位區(qū)，有研究表明，運用

COE分析PEDV流行毒株的流行趨勢、抗原性的變異和遺傳變異情況與運用S基因有很高的相似性，但具有省時、省力和節(jié)省開支等優(yōu)點[10]。

本試驗中，2012-2014年上半年間，我們采集了我國南部地區(qū)7個省市不同的暴發(fā)嚴重腹瀉的疑似感染PEDV豬場的仔豬的小腸或糞便樣品17份，經(jīng)RT-PCR及測序鑒定確定均感染PEDV，并對S基因COE序列進行序列和遺傳進化分析，對PEDV的流行病學和抗原性的深入研究提供參考。有研究表明，PEDV的COE是高度保守的[6]，而本研究中的17株PEDV COE序列與CV777 Vac?cine比對結果表明，這些毒株COE的氨基酸序列發(fā)生了不同程度的點突變現(xiàn)象，點突變的數(shù)目在3～10個之間，這些點突變是否會影響到病毒的抗原特性，是否會導致差的交叉保護，還有待于進一步的研究。

根據(jù)PEDV COE序列構建的系統(tǒng)進化樹將PEDV毒株分為3個主要的大群，我國主要流行的毒株和本研究中的16株毒株均屬于第Ⅰ群，與美國分離株NPL/PEDv/2013和泰國分離株08CB03-2008等屬于同一群，與其親緣關系較近，與韓國分離株KNU-0801、Chinju99親緣關系較遠，雖然第Ⅰ群的遺傳背景較為復雜，但是它們與CV777 Vaccine、Attenuated DR13等弱毒株也處于同一大群中，親緣關系較近。GD/FSss/2014與CV777、DR13等屬于第Ⅱ群，與其余16株毒株有一定的遺傳距離，GD/FSss/2014 COE的氨基酸點突變也較多，可對其做更進一步的研究。

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Genetic variation analysisof porcine epidem ic diarrhea virus in the southern region of China during 2012 to 2014

SU Dan-ping1，LIBing1，2，ZHANG Xian-hao2，CHEN Rui-ai1，2，CAIJia-yue1，HEDong-sheng1，2
（1.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Guangdong Dahuanong Animal Health Products CO.，LTD，Yunfu 527400，China）

In this study，in order to investigate the variation in the core neutralizing epitope（COE）of Sgene of porcine epi?demic diarrhea virus（PEDV），a total of 17 PEDV positive sampleswere collected from different breeding farms from 7 provinces in the southern region of China during 2012 to 2014，and the COEs were amp lified by RT-PCR，cloned and sequenced.Sequence analysis and genetic variation of 17 COEs were compared with other PEDV

trains selected from GenBank.Our results showed that 16 of 17 strainswere closely related to each other and belonged to the first group，and the GD/FSss/2014 strain be?longed to the second group.Sequence analysis showed that the COE of 17 strains shared 92.9%～99.8%nucleotide and 88.6%～100%deduced amino acid identities to each other，and exhibited 93.3%～99.5%nucleotide and 90%～98.6%deduced amino ac?id identitywith the reference PEDV strain of CV777.Compared with the CV777 vaccine strain，the strains sequenced in this study had 95-97.1%nucleotide and 92.9～97.9%deduced amino acid identity.Meanwhile，therewere some amino acidmutations in the COE.This study could provide the theoretical foundation for selection and further study of comprehensive prevention and control of PEDV.

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）；the core neutralizing epitope（COE）；the southern region of China；genetic evolution

s：HEDong-sheng；CHEN Rui-ai是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起豬的一種急性高度接觸性腸道傳染病，以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死性為主要特征[1]。自1971年比利時和英國首次報道PED之后，在世界各地陸續(xù)發(fā)生[2]。近幾年PED在我國頻繁暴發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。

S852.65+1

A

0529-6005（2015）11-0012-04

2014-10-10

廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司2012年科研項目

蘇丹萍（1965-），女，實驗師，本科，主要從事獸醫(yī)傳染病學的研究，E-mail：sdp8528@163.com

賀東生，E-mail：Dhe@scau.edu.cn；陳瑞愛，E-mail：chensa727@126.com