楊銘德，焦燕，李新，溫慧洋

內(nèi)蒙古師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022

基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同鹽堿程度土壤甲烷氧化菌比活性的研究

楊銘德，焦燕*，李新，溫慧洋

內(nèi)蒙古師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022

為了探究不同鹽堿程度土壤甲烷氧化菌比活性與甲烷吸收速率的關(guān)系，通過室內(nèi) CH4培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究3種不同鹽堿程度土壤，即：輕度鹽化土壤（SA）、強(qiáng)度鹽化土壤（SB）、鹽土（SC）CH4吸收速率和甲烷氧化菌比活性。以含有甲烷氧化菌功能基因pmoA片段的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r2為0.9977，擴(kuò)增效率為 86%，溶解曲線峰值均一。結(jié)果表明：輕度鹽化土壤（SA）、強(qiáng)度鹽化土壤（SB）、鹽土（SC）CH4吸收速率分別為28.4、20.6、17.7 ng·kg-1·h-1，表現(xiàn)為輕度鹽化土壤（SA）>強(qiáng)度鹽化土壤（SB）>鹽土（SC）。土壤CH4吸收速率與土壤甲烷氧化菌比活性顯著正相關(guān)，Person相關(guān)系數(shù)r=0.788（P=0.012，n=9）。由Monte Carlo法檢驗(yàn)后表明：pH、土壤浸提液電導(dǎo)率 EC與土壤甲烷氧化菌比活性顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.943（P=0.000 1，n=9）和-0.895（P=0.001，n=9），而容重ρb、總磷TP、總氮TN、有機(jī)碳OC與土壤甲烷氧化菌比活性無顯著相關(guān)性（P>0.05）。較高pH和EC的鹽堿土壤，土壤甲烷氧化菌比活性低，CH4吸收速率低。

鹽堿土壤；PCR；甲烷氧化菌；吸收速率；比活性

CH4是重要的溫室氣體，每年大約有 470 Tg CH4在大氣中被吸收，其導(dǎo)致氣候變暖的效能是等量 CO2的 20～30倍（Cicerone和 Oremland，1988）。好氣性的旱地土壤是目前唯一已知的由生物氧化CH4的匯，消耗全球大氣CH4的10%（張玉銘等，2011）。甲烷氧化菌在大氣中 CH4的氧化方面起著重要的作用。土壤中甲烷氧化菌細(xì)胞以CH4為唯一的碳源和能源，其內(nèi)的甲烷單氧酶（MMO）在分子氧的作用下，依靠甲醇脫氫酶（MDH）、甲醛脫氫酶（FADH）和甲酸脫氫酶（FDH）的途徑氧化成CO2和H2O。由于傳統(tǒng)檢測(cè)甲烷氧化菌含量的方法存在諸多問題，如培養(yǎng)法操作繁瑣，勞動(dòng)強(qiáng)度大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以滿足大批量樣品快速檢測(cè)要求等。陳中云等（2001）利用傳統(tǒng)的滾管法技術(shù)需要制備甲烷氧化菌固體培養(yǎng)基分裝于厭氧試管中，大批量樣品耗時(shí)長(zhǎng)。Amann（1995）等證實(shí)傳統(tǒng)的依賴于培養(yǎng)的方法已無法充分描述微生物的多樣性，可能會(huì)錯(cuò)失 99%以上的微生物種類。因此，選用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR快速檢測(cè)甲烷氧化菌的新方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。仝川和佘晨興（2011）利用 PCR-DGGE技術(shù)分析了自然濕地微生物群落多樣性。幾乎所有好氧甲烷氧化菌都含有 MMO，因此，利用顆粒性甲烷單加氧酶（pMMO）的pmoA基因片段作為生物標(biāo)記物進(jìn)行好氧甲烷氧化菌生態(tài)學(xué)研究已被廣泛應(yīng)用（贠娟莉，2013）。許科偉等（2013）通過建立基于功能基因pmoA的定量 PCR技術(shù)，對(duì)油氣田土壤樣品中不同種類甲烷氧化菌豐度進(jìn)行測(cè)定；HenckeL和 Jackel（2000）通過標(biāo)記甲烷氧化菌MMO的pmoA基因，采用PCR技術(shù)解釋了 CH4氧化的活性高低。單個(gè)甲烷氧化菌的活性可以用比活性的大小表征，土壤甲烷氧化菌的比活性由測(cè)得的 CH4吸收速率和甲烷氧化菌豐度值決定的（Kolb等，2005）。高的甲烷氧化菌豐度或是較高的甲烷氧化菌比活性是決定土壤吸收 CH4的先決條件（Conrad，1984）。Menyailo等（2008）發(fā)現(xiàn)土壤甲烷氧化菌比活性在俄羅斯草原種植人工林后土壤CH4吸收速率變化中扮演重要角色。楊芊葆等（2010）通過對(duì)旱地農(nóng)田土壤的研究發(fā)現(xiàn)比活性越大，CH4吸收速率越大。

目前，CH4研究主要集中在草地（Unteregelsbacher等，2013；Wei等，2014）、農(nóng)田（張雪松等，2006；Jacinthe和 Lal，2005）、森林（Zhang等，2014；Xu等，2014）等不同利用方式的土壤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球鹽堿土壤面積已達(dá)1.0×109hm2，占全球土壤總面積的30%（Gao等，2011）。但對(duì)于鹽堿土壤甲烷氧化菌的比活性研究仍較少，鹽堿土壤影響 CH4吸收研究的相關(guān)報(bào)道也較少。零星研究表明，土壤鹽含量增加抑制CH4吸收（Whalen，2000）。因此本文通過室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)探討不同鹽堿程度土壤甲烷氧化菌比活性，為野外鹽漬化土壤 CH4吸收速率的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

供試土壤采于內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗，地處黃河北岸，河套平原東端，該地屬溫帶大陸性氣候，冬寒而長(zhǎng)，夏熱而短，干旱少雨，春季風(fēng)沙較大，最高氣溫為 39.7 ℃，最低氣溫是-30.7 ℃，年平均氣溫為 7.7 ℃。年平均日照時(shí)間是 3212.5 h，無霜期共 167 d。降水集中于 7─9月，年平均降水量為 213.5 mm，最大降水量為 8月，極端日降水量可達(dá)109.6 mm。

1.2 樣品采集

為避免地形等因素影響，研究樣區(qū)選擇地勢(shì)平坦的地方，并按照鄰近原則布置樣點(diǎn)。試驗(yàn)于2014年 5月（土壤未種植作物），選取樣本S1～S9，距離地表0～20 cm取樣，依據(jù)土壤鹽化含量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表1），選取3種不同鹽堿程度土壤（表 2），將小區(qū)土壤（S1、S2、S3）劃分為 SA（輕度鹽化土），小區(qū)土壤S4～S6劃分為SB（強(qiáng)度鹽化土），小區(qū)土壤 S7～S9土壤劃分為 SC（鹽土）。1份土壤風(fēng)干磨碎過2 mm篩用于理化性質(zhì)測(cè)定和 CH4培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；另 1份迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，分裝于若干無菌離心管中，于-8 ℃保存。

表1 土壤鹽化分級(jí)指標(biāo)(王遵親，1993)Table 1 Soil salinization classification

表2 試驗(yàn)土壤鹽分含量Table 2 Salinity of different soil samples %

1.3 土壤基本理化性質(zhì)

土壤基本理化測(cè)定方法（鮑士旦，2000）如下：pH以1∶2.5的土水比，復(fù)合電極法測(cè)定；EC以 1∶5的土水比，復(fù)合電極法測(cè)定；土壤容重用環(huán)刀法測(cè)定；土壤質(zhì)地用比重計(jì)速測(cè)法測(cè)定；土壤OC選用重鉻酸鉀容量-外加熱法；土壤 TP用HClO4-H2SO4測(cè)定；土壤TN用凱氏定氮儀測(cè)定。土壤 CO32-、HCO3-測(cè)定：電位滴定法。Cl-測(cè)定：硝酸銀滴定法。SO42-測(cè)定：EDTA容量法。Ca2+和Mg2+測(cè)定：EDTA容量法。K+、Na+測(cè)定：火焰光度法。土壤基本理化性質(zhì)如表3所示。

1.4 總DNA提取

DNA提取采用CTAB/SDS方法提取。取土壤樣品 0.5 g，液氮研磨后置于 10 mL無菌離心管中，加入4 mL DNA抽提緩沖液（1% CTAB；100mM Tris-HCl，pH8.0；20 mM EDTA，pH8.0；700 mM NaCl pH8.0）和 200 μL蛋白酶 K，充分混勻。在 37 ℃放置 30 min，每隔 10 min混勻 1次。加入800 μL 10% SDS，充分混勻。在65 ℃水浴1 h，每隔15 min混勻1次。在室溫下于12000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至一批新的2 mL無菌離心管中。1份加入等體積 V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1，1份加入等體積氯仿/異戊醇，1份加入 0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇。每份充分混勻，在-20 ℃放置20 min。棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌DNA沉淀。離心，風(fēng)干，加40 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀。取2 μL DNA樣品，瓊脂糖電泳檢測(cè)。將DNA溶液于-20 ℃冰箱保存。

表3 試驗(yàn)土壤基本理化性質(zhì)Table 3 Physico-chemical properties of soil samples

1.5 PCR質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.5.1 目的基因的擴(kuò)增

pmoA基因廣泛運(yùn)用于環(huán)境樣品中甲烷氧化菌的檢測(cè)與定量化，在pmoA定量過程中，所采用的引物（Adrian等，2011）為A189f（5’-GGN GAC TGG GAC TTC TGC-3’）和A682r（5’-GAA SGC NGA GAA GAA SGC-3’），利用2對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增樣品 DNA中細(xì)菌數(shù)目的 DNA序列。qPCR反應(yīng)所需體系為：PCR擴(kuò)增體系（25 μL）為 10×PCR buffer 2.5 μL；dNTP（2.5 mM）1.6 μL；primers F(5P)1 μL；primers R (5P)1 μL；Taq(5 U·μL-1) 0.125 μL；模板DNA 50 ng；補(bǔ)H2O 16.775 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。

1.5.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、測(cè)序與濃度測(cè)定

PCR產(chǎn)物采用 AXYGEN公司 DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化。純化連接到pEASY-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)插入的細(xì)菌 DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定。依據(jù)測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品是否構(gòu)建合格。序列正確的陽(yáng)性克隆子利用試劑盒提取質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，置于-20 ℃?zhèn)溆?。根?jù)測(cè)定的核酸濃度，計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中甲烷氧化菌pmoA基因片段拷貝數(shù)。PCR儀為 Biometra公司生產(chǎn)的 T-gradient，凝膠成像儀為 Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將制備好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度質(zhì)量濃度稀釋，得到 4個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)模板。每個(gè)稀釋度模板質(zhì)量濃度取 3個(gè)平行樣，記錄結(jié)果，取平均值，繪制溶解性曲線。以 qPCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以不同模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 CH4室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

稱取過篩的 S1～S9土壤樣品 50 g（相當(dāng)于烘干土質(zhì)量），裝入 250 mL規(guī)格的培養(yǎng)瓶（Glasgeratebau OCHS GmbH），加入滅菌去離子水5 mL，預(yù)培養(yǎng)7 d，激活土壤微生物，7 d后取出培養(yǎng)瓶，調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系中土壤質(zhì)量含水率為體積分?jǐn)?shù)25%，T型硅膠塞封口。于25 ℃下恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)360 h。每個(gè)處理均設(shè)置3次重復(fù)。為了保持瓶?jī)?nèi)壓力恒定，在向瓶?jī)?nèi)注射純 CH4之前用注射器從瓶?jī)?nèi)抽出相同體積的空氣，前 12次每隔12 h抽取培養(yǎng)瓶中混合氣體，之后每24 h抽1次，CH4質(zhì)量濃度用改進(jìn)后的氣相色譜儀（Agilent 6820，Agilent Technologies）測(cè)定。儀器配備：FID 檢測(cè)器和不銹鋼的 Porapak Q（80/100 mesh），工作條件設(shè)定：柱溫、進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度分別設(shè)為 55、130、250 ℃，載氣（氮?dú)猓?、FID氫氣和 FID空氣的流速分別設(shè)為 30、30和 400 mL·min-1，CH4的吸收速率用 ng·kg-1·h-1表示。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

甲烷氧化菌豐度(copies)=總體積×摩爾數(shù)×樣品中檢測(cè)目標(biāo)的質(zhì)量濃度/(pEASY-T堿基數(shù)×脫氧核糖核苷酸平均分子量) （1）

式中：總體積表示提取到的 DNA的總體積，μL；摩爾數(shù)：DNA的物質(zhì)的量，個(gè)·mol-1；樣品中檢測(cè)目標(biāo)的質(zhì)量濃度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品，用熒光定量得到的數(shù)據(jù)換算出樣品中目的片段的質(zhì)量濃度，ng·μL-1；pEASY-T堿基數(shù)：由pEASY-T載體構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品堿基對(duì)的數(shù)量，個(gè)；脫氧核糖核苷酸平均分子量，607.4 g·mol-1。

CH4吸 收 速 率 ： P=(dc/dt)×(Vh/Ws)× (MW/Vm)×(Tst/Tst+T) （2）

式中：P為 CH4吸收速率，ng·kg-1·h-1；dc/dt為單位時(shí)間培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) CH4質(zhì)量濃度的變化量；Vh指培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)部空間的體積，mL；Ws為土樣的質(zhì)量，g；MW表示CH4的分子量，16.04；Vm為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下 1 mol氣體的體積，22.4 L；T為培養(yǎng)溫度，℃；Tst為標(biāo)準(zhǔn)溫度。

土壤氧化菌比活性=單位土壤甲烷吸收速率(2)/該土壤pmoA基因豐度值(1) （3）

采用OriginPro8和Excel2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖，SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（AVNOA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤甲烷氧化菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立

經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，土壤樣品細(xì)菌基因組 DNA能提取較高的質(zhì)量，純度較高，可直接用于 PCR擴(kuò)增（圖1）。

圖1 土壤細(xì)菌基因組DNA提取聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig. 1 The polyacrylamide gel electrophoresis of the bacteria DNA in soil

利用核酸定量?jī)x測(cè)定質(zhì)粒質(zhì)量濃度，計(jì)算得到甲烷氧化菌 pmoA基因片段的質(zhì)量濃度為 776 ng·μL-1，將質(zhì)粒提取液10倍系列稀釋得到 4個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)模板，各取 2 μL稀釋標(biāo)準(zhǔn)品作為熒光定量PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增，在熒光定量PCR擴(kuò)增指數(shù)期，畫一條閥值線，本研究設(shè)定閥值等于0.020208（圖2）。依據(jù)該閥值線，確定在PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù) Ct。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品 4個(gè)濃度梯度的模板 Ct值，計(jì)算并繪制反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-0.2694x(Ct)+3.2796，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-0.2694，相關(guān)系數(shù) r2=0.9977，擴(kuò)增效率 E=86%（圖3）。根據(jù)未知樣品Ct值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到未知樣品初始模板量，即3種不同鹽堿程度土壤的pmoA基因數(shù)。繪制各濃度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)時(shí)熒光定量過程中的熔點(diǎn)曲線。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的熔點(diǎn)曲線具有單一特異性的峰，擴(kuò)增產(chǎn)物溶解溫度 Tm值均一，為(90.4±1.1) ℃。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物特異性良好且無引物二聚體影響（圖4）。

圖2 熒光定量PCR特異性評(píng)價(jià)的擴(kuò)增曲線Fig. 2 Amplification curve for fluorescence qPCR specificity evaluation

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curve of the Real-Time qPCR

2.2 土壤CH4吸收速率

由單因素AVNOA方差分析可以發(fā)現(xiàn)，不同鹽堿程度土壤之間 CH4吸收速率具有明顯的差異性（t=18.027，P=0.0001）（圖 5）。經(jīng)計(jì)算可知SA、SB、SC土壤 CH4吸收速率數(shù)值大小依次為28.4、20.6、17.7 ng·kg-1·h-1，即SA>SB>SC，隨著土壤鹽堿程度的增加，CH4吸收速率呈現(xiàn)遞減變化趨勢(shì)。相比較鹽土，輕度鹽化土壤 CH4吸收速率增加了60.5%，表現(xiàn)了較高的CH4吸收潛力。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔點(diǎn)曲線Fig. 4 Melting curve of the Real-Time qPCR

圖5 不同鹽堿程度土壤CH4吸收速率Fig. 5 CH4uptake rates of different saline soils

2.3 土壤甲烷氧化菌豐度和比活性分析

單因素AVNOA方差分析表明，不同鹽堿程度土壤之間的甲烷氧化菌豐度（t=11.684，P= 0.0001）和比活性（t=9.227，P=0.0001）具有明顯的差異性（圖 6、7）。由公式（1）得出土壤甲烷氧化菌豐度值分別為 13.25×103、19.90×103、40.18×103copies，表現(xiàn)為SASB>SC，SA（輕度鹽化土）、SB（強(qiáng)度鹽化土）、SC（鹽土）數(shù)值大小分別為25.13×10-4、14.65×10-4、13.58×10-4ng·kg-1·copies-1·h-1，鹽土甲烷氧化菌比活性最低。

圖6 不同鹽堿程度土壤氧化菌比活性Fig. 6 Methanotrophs specific activity in different saline soils

圖7 不同鹽堿程度土壤氧化菌豐度Fig. 7 Methanotrophs abundance in different saline soils

2.4 土壤 CH4吸收速率與甲烷氧化菌豐度、甲烷氧化菌比活性以及與環(huán)境因子的冗余分析

利用Canoco 4.5 for windows軟件的除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（Detrended correspondence，DCA），采用線性擬合模型，選擇冗余分析法。由圖8表明，以CH4吸收速率的矢量箭頭為軸可將樣本分為3種不同鹽堿程度土壤 SA（S1～S3）、SB（S4～S6）、SC（S7～S9），土壤 S1～S9指代野外小區(qū)土壤。分類結(jié)果與土壤鹽化分級(jí)結(jié)果一致。土壤 CH4吸收速率與甲烷氧化菌比活性的投影在第一主成分軸的正方向，甲烷氧化菌比活性越大，CH4吸收速率越大，r=0.788（P=0.012，n=9），土壤 CH4吸收速率與土壤甲烷氧化菌豐度投影在 X軸的方向相反，不具有顯著相關(guān)性 r=-0.099（P=-0.099，n=9）。第一主成分軸（X軸）和第二主成分軸（Y軸），2個(gè)主成分軸共解釋環(huán)境變量的 97.0%，由Monte Carlo法檢驗(yàn)后表明：pH、EC與土壤甲烷氧化菌比活性負(fù)相關(guān)，Person相關(guān)系數(shù)依次為r為-0.943（P=0.0001，n=9）和-0.895（P=0.001，n=9），容重ρb、總磷TP、總氮TN、有機(jī)碳OC與土壤甲烷氧化菌比活性無顯著相關(guān)性（P>0.05）。表明 pH、EC越高的土壤，甲烷氧化菌比活性越低，CH4吸收速率越低。

圖8 甲烷與環(huán)境因子的冗余分析Fig. 8 Redundancy analysis of soil properties and environmental factors

3 討論

不同鹽堿程度土壤SA、SB、SC的CH4吸收速率表現(xiàn)為輕度鹽化土壤（SA）>強(qiáng)度鹽化土壤（SB）>鹽土（SC），隨著土壤鹽堿程度的增加，pH與鹽含量高的土壤，CH4吸收速率低。ZHANG等（2011）發(fā)現(xiàn)在相同的質(zhì)地狀況下，不同鹽漬化土壤，輕度鹽化土壤有較好的 CH4吸收潛力。Whalen（2000）發(fā)現(xiàn)高原凍土（5～15 cm）添加的氯化鈉質(zhì)量濃度增加 20倍，CH4吸收速率降低75%。因此，鹽含量高的土壤CH4吸收速率較低可能是鹽土中過高的氯離子抑制了甲烷氧化菌的活性，導(dǎo)致土壤 CH4吸收速率降低（Zhang等，2011）。

本研究發(fā)現(xiàn)3種不同鹽堿程度土壤鹽土具有較高的甲烷氧化菌豐度。Tsubota等（2005）表明，溫泉底泥土壤中性嗜溫型甲烷氧化菌能忍受質(zhì)量濃度為 3%的 NaCl，Dimitry等（2000）分離出來的5種高鹽底泥樣品中，得到一種新的Ⅰ型甲烷氧化菌，其能夠在 pH=10的堿性條件和鈉離子質(zhì)量濃度為 1 M 的環(huán)境下生存。3種不同鹽堿程度土壤中，鹽土同時(shí)也具有較低的甲烷氧化菌比活性。鄧永翠和崔驍男（2013）研究表明，豐度最高的Methylocella甲烷氧化菌，其氧化 CH4活性低。鹽含量高的鹽堿土壤，甲烷氧化菌比活性低，這可能的原因是甲烷氧化菌種群的另外一種 pMMO酶在鹽堿程度高的土壤停止表達(dá)（鄧永翠和崔驍男，2013）。

本研究表明，CH4吸收速率與甲烷氧化菌比活性正相關(guān)（r=0.788，P=0.012），鹽堿程度高的土壤，甲烷氧化菌比活性低，CH4吸收速率低。楊芊葆等（2010）的研究也表明，暗棕土壤甲烷氧化菌的比活性與 CH4吸收速率具有正相關(guān)關(guān)系。Menyailo等（2008）發(fā)現(xiàn)，對(duì)于改造后的俄羅斯草原土壤甲烷氧化菌比活性影響土壤 CH4吸收速率。當(dāng)今國(guó)際刊物大多直接用土壤浸提液電導(dǎo)率（EC）來表示土壤鹽漬化程度（鄧麗娟，2011）。土壤性質(zhì)（如 pH和 EC）是調(diào)控細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子（Catherine和Rob，2007）。本研究Monte Carlo檢驗(yàn)后表明：土壤pH、EC與土壤甲烷氧化菌比活性顯著負(fù)相關(guān)。因此，pH和EC含量高的鹽堿土壤，土壤甲烷氧化菌比活性低，土壤CH4吸收潛力低。

4 結(jié)論

（1）不同鹽堿程度土壤 CH4吸收速率表現(xiàn)為輕度鹽化土壤（SA）>強(qiáng)度鹽化土壤（SB）>鹽土（SC），即隨土壤 pH和土壤浸提液電導(dǎo)率（EC）的增加，CH4吸收速率降低。

（2）不同鹽堿程度土壤甲烷氧化菌比活性越低，CH4吸收速率越低。pH和 EC越高的鹽堿土壤，甲烷氧化菌比活性越低，CH4吸收速率越低。土壤甲烷氧化菌比活性與土壤容重 ρb、總磷 TP、總氮TN、有機(jī)碳OC無顯著相關(guān)性。

ADRIAN H, CLAUDIA L, PETER F. 2011. Recovery of methanotrophs from disturbance: population dynamics, evenness and functioning [J]. The ISME Journal, 5(4): 750-758.

AMANN R I, LUDWIG W, SCHLEIFER K H. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation [J]. Microbiological Reviews, 59(1): 143-169.

CATHERINE A L, ROB K. 2007. Global patterns in bacterial diversity [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(27): 11436-11440.

CICERONE R J, OREMLAND R S. 1988. Biogeochemical aspects of atmospheric methane [J]. Global Biogeochemical Cycles, 2(4): 299-327.

CONRAD R. 1984. Capacity of aerobic microorganisms to utilize and grow on atmospheric trace gases (H2, CO, CH4, OCS, N2O, and NO) [J]. American society for microbiology, 60(4): 461-467.

DIMITRY Y, SOROKIN B E, JONES J, et al. 2000. An obligate methylotrophic, methane-oxidizing methylomicrobium species from a highly alkaline environment [J]. Extremophiles, 4(3): 145-155.

GAO F, HUANG Q, SUN X Y, et al. 2011. Study on dynamic changes of the soil salinization in the upper stream of the tarim river based on RS and GIS [J]. Procedia Environmental Sciences, 11(C): 1135-1141.

HENCKEL T, JACKEL U. 2000. Molecular analyses of novel methanotrophic communities in forest soil that oxidize atmospheric [J]. Applied and Environmental Microbiology, 66(5): 1801-1808.

JACINTHE P A, LAL R. 2005. Labile carbon and methane uptake as affected by tillage intensity in a Mollisol [J]. Soil and Tillage Research, 80(1-2): 35-45.

KOLB S, KNIEF C, DUNFIELD P F, et al. 2005. Abundance and activity of uncultured methanotrophic bacteria involved in the consumption of atmospheric methane in two forest soils [J]. Environ Microbiol, 7(8): 1150-1161.

MENYAILO O V, HUNGATE B A, ABRAHAM W R, et al. 2008. Changing land use reduces soil CH4uptake by altering biomass and activity but not composition of high-affinity methanotrophs [J]. Global Change Biology, 14(10): 2405-2419.

TSUBOTA J, ESHINIMAEY B T, KHMELENINA V N, et al. 2005. Methylothermus thermalis gen. nov., sp. nov., a novel moderately thermophilic obligate methanotroph from a hot spring in Japan [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55(5): 1877-1884.

UNTEREGELSBACHER S, GASCHE R, LIPP L, et al. 2013. Increased methane uptake but unchanged nitrous oxide flux in montane grasslands under simulated climate change conditions [J]. European Journal of Soil Science, 64(5): 586-596.

WEI D, XU R, TENZIN T, et al. 2014. Fluxes of methane, carbon dioxide and nitrous oxide in an alpine wetland and an alpine grassland of the Tianshan Mountains, China [J]. Journal of Arid Land, 6(6): 717-724.

WHALEN S C. 2000. Influence of N and non-N salts on atmospheric methane oxidation by upland boreal forest and tundra soils [J]. Biology and Fertility of Soils, 31(3-4): 279-287.

XU M J, CHENG S L, FANG H J, et al. 2014. Low-Level Nitrogen Addition Promotes Net Methane Uptake in a Boreal Forest across the Great Xing'an Mountain Region, China [J]. Forest Science, 60(5): 973-981.

ZHANG J F, LI Z J, NING T Y, et al. 2011. Methane uptake in salt-affected soils shows low sensitivity to salt addition [J]. Soil Biology and Biochemistry, 43(7): 1434-1439.

ZHANG W, WANG K, LUO Y, et al. 2014. Methane uptake in forest soils along an urban-to-rural gradient in Pearl River Delta, South China [J]. Scientific Rep, 4:5120.

鮑士旦. 2000. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.

陳中云, 閔航, 陳美慈, 等. 2001. 不同水稻土甲烷氧化菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量與甲烷排放量之間相關(guān)性的研究[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 21(9): 1499-1505.

鄧麗娟. 2011. 土壤浸提液電導(dǎo)率與鹽分關(guān)系的通徑分析[J]. 地下水, 33(6): 20-21.

鄧永翠, 崔驍男. 2013. 青藏高原濕地好氧甲烷氧化菌的群落多樣性及活性研究[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院: 130.

仝川, 佘晨興. 2011. 自然濕地土壤產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌多樣性的分子檢測(cè)[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 31(14): 4126-4135.

王遵親. 1993. 中國(guó)鹽漬土[M]. 北京: 科學(xué)出版社.

許科偉, 邵明瑞, 湯玉平, 等. 2013. 三種油氣指示菌定量PCR方法的建立及其在油氣田土壤中的初步應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 4(4): 172-178.

楊芊葆, 范分良, 王萬雄, 等. 2010. 長(zhǎng)期不同施肥對(duì)暗棕壤甲烷氧化菌群落特征與功能的影響[J]. 環(huán)境科學(xué), 31(11): 2756-2762.

贠娟莉. 2013. 好氧甲烷氧化菌生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 33(21): 6774-6785.

張雪松, 申雙和, 李俊, 等. 2006. 華北平原冬麥田土壤CH4的吸收特征研究[J]. 南京氣象學(xué)院學(xué)報(bào), 29(2): 181-188.

張玉銘, 胡春勝, 張佳寶, 等. 2011. 農(nóng)田土壤主要溫室氣體(CO2、CH4、N2O)的源/匯強(qiáng)度及其溫室效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 19(4): 966-975.

Specific Activity of Methanotrophs in Saline-Alkaline Soils Retrieved from A Fluorescent Quantitative Real-time PCR Technique

YANG Mingde, JIAO Yan*, LI Xin, WEN Huiyang
Chemistry & Environment Science College, Inner Mongolia Normal University, Hohhot 010022, China

In order to explore the relationship between Specific Activity of methanotrophs and methane uptake rate in different levels of saline-alkaline soils, most studies on CH4uptake potential in saline-alkaline soils are limited to confined field trials. In methanotrophs culture experiments, we used fluorescent quantitative real-time PCR technique to investigate CH4 uptake rate and methanotrophs specific activity in three saline-alkaline soils: slightly saline soil (SA), severely saline soil (SB), saline soil (SC). The recombinant plasmid containing pmoA gene was used as standards to optimize the experimental conditions and generate a standard curve. The correlation coefficient (r2) of the standard curve was 0.997 7 and the amplification efficiency was 86%. The dissocition curves of the real time qPCR demonstrated uniform peaks. The results showed that CH4uptake rates of SA, SBand SCwere negatively related to soil salinity, i.e., SA>SB>SC. Soil CH4uptake rate increased with the growth of specific activity, showing a significant positive correlation (r=0.788, P=0.012, n=9). Monte Carlo test showed that methanotrophs specific activity was significantly negatively correlated with pH (r=-0.943, P=0.0001) and EC (r=-0.895, P=0.001), while correlations between methanotrophs specific activity and bulk density(ρb), total phosphorus(TP), total nitrogen(TN) and organic carbon(OC) were insignificant (P>0.05). Salinealkaline soils of high pH and EC appeared to have lower methanotrophs specific activity and CH4uptake rates.

saline-alkaline soils; PCR; methanotrophs; methane uptake rate; specific activity

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.05.012

X171.3；S154

A

1674-5906（2015）05-0797-07

楊銘德，焦燕，李新，溫慧洋. 基于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)不同鹽堿程度土壤甲烷氧化菌比活性的研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2015, 24(5): 797-803.

YANG Mingde, JIAO Yan, LI Xin, WEN Huiyang. Specific Activity of Methanotrophs in Saline-Alkaline Soils Retrieved from A Fluorescent Quantitative Real-time PCR Technique [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(5): 797-803.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41165010；41375144）；2013內(nèi)蒙古高等學(xué)?！扒嗄昕萍加⒉拧敝С钟?jì)劃資助（NJYT-13-B06）；內(nèi)蒙古師范大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CXJJS14060）

楊銘德（1990年生），男，碩士研究生。E-mail：279314135@qq.com *通信作者：焦燕（1977年生），女，教授，博士，主要從事碳循環(huán)與全球變化研究。E-mail：jiaoyan@imnu.edu.cn

2015-02-26