高云霓，葛芳杰，劉碧云*，魯志營(yíng)，何燕，張甬元，吳振斌

1. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所//淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072

不同暴露方式下水生植物化感物質(zhì)抑藻效應(yīng)的比較研究

高云霓1,2，葛芳杰2，劉碧云2*，魯志營(yíng)2，何燕2，張甬元2，吳振斌2

1. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所//淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072

為研究水生植物釋放的化感物質(zhì)在生態(tài)水平上的有效作用模式，選擇水生植物釋放的壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸等不同類型化感物質(zhì)，比較高劑量單次暴露與低劑量多次暴露對(duì)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）生長(zhǎng)的影響，探討化感物質(zhì)不同投加頻次、劑量和光暗條件等對(duì)多次暴露抑藻效果的影響。結(jié)果顯示，3種化感物質(zhì)以2 h為間隔、分5次、每次添加0.5 mg·L-1的方式暴露時(shí)均表現(xiàn)出比以總劑量2.5 mg·L-1單次暴露更強(qiáng)的抑藻效果，在實(shí)驗(yàn)的第7天壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸的抑藻率是單次暴露組的1.8、1.1和1.6倍。以1 h間隔、10次暴露的壬酸和N-苯基-1-萘胺，抑制率隨著單次添加量的減少而降低，但在單次暴露劑量低至0.1 mg·L-1時(shí)兩種物質(zhì)仍能顯著抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，第7天N-苯基-1-萘胺的平均生長(zhǎng)抑制率仍可以達(dá)到50.25%。壬酸和N-苯基-1-萘胺在銅綠微囊藻生長(zhǎng)的黑暗階段多次暴露比在光照階段的抑藻效果好，第3天的平均抑制率分別是是光照階段的2.2和1.3倍。上述結(jié)果表明，水生植物釋放的化感物質(zhì)可以通過低劑量多次暴露實(shí)現(xiàn)比高劑量單次暴露更強(qiáng)的抑藻效果。因此，加強(qiáng)對(duì)化感物質(zhì)多次暴露方式下抑藻作用的研究將推動(dòng)自然環(huán)境中水生植物化感作用生態(tài)機(jī)制的進(jìn)一步揭示，有利于指導(dǎo)水生植物化感作用的理論研究和實(shí)踐應(yīng)用。

壬酸；N-苯基-1-萘胺；咖啡酸；多次暴露；銅綠微囊藻

水生植物是健康水生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)者，對(duì)維持水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用，除了可以吸收水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為其他生物提供生境外，還能釋放化感物質(zhì)抑制周圍藻類的生長(zhǎng)（吳振斌等，2011）。由于化感物質(zhì)大都為植物的次生代謝產(chǎn)物，在自然水體中易降解，生態(tài)安全性好，因此利用化感活性水生植物及其化感物質(zhì)控制藻類生長(zhǎng)，恢復(fù)水生植物占優(yōu)勢(shì)的清水穩(wěn)態(tài)生態(tài)系統(tǒng)被認(rèn)為是一種行之有效且生態(tài)安全的策略（Hilt等，2008；Shao等，2013）。大量野外原位實(shí)驗(yàn)和室內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)廣泛證實(shí)蘆葦（Phragmites communis）、香蒲（Typha angustata）、水蔥（Scirpus validus）等挺水植物，穗花狐尾藻（Myriophyllum spicatum）、伊樂藻（Elodea nuttallii）、眼子菜（Potamogeton spp.）等沉水植物對(duì)藻類尤其是有害藍(lán)藻銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）均具有很強(qiáng)的化感抑制活性（Li和Hu，2005；Erhard和Gross，2006；Nakai等，2012；胡陳艷等，2010）。酚酸、脂肪酸、生物堿、類萜等類別的化感物質(zhì)不斷地從水生植物體內(nèi)及其分泌物中被分離出來，并得到鑒定（Waridel等，2004；Nakai等，2005；Gao等，2011；孫文浩等，1993）。

前期的草藻共培養(yǎng)系統(tǒng)中，1 g·L-1（以FW計(jì)）的穗花狐尾藻就能顯著抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，而以100 g·L-1（以FW計(jì)）密度培養(yǎng)的穗花狐尾藻種植水對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)沒有顯著影響（Nakai等，1999）。我們的早期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，馬來眼子菜（Potamogeton malainus）與斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）共培養(yǎng)系統(tǒng)中，2.5 g·L-1（以FW計(jì)）的馬來眼子菜即可顯著抑制起始密度為 7×107cells·L-1斜生柵藻的生長(zhǎng)，而3.75 g·L-1（以FW計(jì)）的眼子菜種植水仍不會(huì)影響斜生柵藻的生長(zhǎng)（Wu等，2007）。比較而言，草藻共培養(yǎng)系統(tǒng)能更好地模擬自然水生態(tài)系統(tǒng)中水生植物與藻類的共存狀態(tài)，活體水生植物可以實(shí)時(shí)釋放化感物質(zhì)抑制藻類生長(zhǎng)。而植物種植水中僅含有植物已釋放到水中的化感物質(zhì)，卻沒有化感物質(zhì)的補(bǔ)充和累積，其含量可能不足以影響到藻類的生長(zhǎng)。我們的前期研究顯示沉水植物輪葉黑藻（Hydrilla verticillata）和苦草（Vallisneria natans）種植水中單種酚酸的質(zhì)量濃度不超過50 μg·L-1（Gao等，2011）。在穗花狐尾藻種植水中檢測(cè)到的質(zhì)量濃度最高的化感物質(zhì)鞣花酸也僅有76.6 μg·L-1（Nakai等，2000）。

常用的化感物質(zhì)抑藻活性測(cè)試方法與大部分種植水抑藻實(shí)驗(yàn)方法類似，即在暴露開始時(shí)一次性添加一定劑量的化感物質(zhì)到受試藻液中，然后觀察藻體生長(zhǎng)和生理參數(shù)對(duì)化感物質(zhì)的響應(yīng)，最常用的指標(biāo)即化感物質(zhì)對(duì)藻類生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的半數(shù)抑制濃度EC50（Xiao等，2014；張庭廷等，2009）。根據(jù)這種測(cè)試評(píng)價(jià)體系，已發(fā)現(xiàn)的抑藻活性最強(qiáng)的水生植物化感物質(zhì)的EC50大都在0.5 mg·L-1以上（Nakai等，2000，2005；Li和Hu，2005），顯著高于目前所檢測(cè)到的種植水中化感物質(zhì)的含量。由此我們推測(cè)，水生植物釋放到水中的化感物質(zhì)對(duì)藻類的抑制作用可能具有持續(xù)累積效應(yīng)，而不是高劑量一次性的作用。

為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本研究選擇了壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸等常見的水生植物化感抑藻物質(zhì)，比較單次與多次暴露對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制效果，并從暴露頻次、暴露劑量和暴露條件等方面初步探討水生植物釋放化感物質(zhì)抑制藻類生長(zhǎng)的作用模式，以期從生態(tài)水平上揭示水生植物的化感抑藻機(jī)制，為其科學(xué)應(yīng)用于受損生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)和有害藻華的生態(tài)控制提供更加充分的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)藻種銅綠微囊藻（FACHB 905）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，純培養(yǎng)期間為單細(xì)胞形態(tài)。保種和實(shí)驗(yàn)期間均用無菌BGII培養(yǎng)基在2000 lx，12 h∶12 h光暗比，(25±1) ℃的條件下培養(yǎng)。每天早晚各手工振搖1次。抑藻測(cè)試采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的銅綠微囊藻細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)所選水生植物的典型化感物質(zhì)包括壬酸（N5502-25G, φ≥97%, Sigma, Germany）、N-苯基-1-萘胺（104043-500G, 98%, Sigma-Aldrich, Germany）和咖啡酸（C0625-5G, φ≥98%, Sigma, Germany）。母液配制溶劑為分析純二甲亞砜（Tidea, America）。

1.2 化感物質(zhì)暴露方式設(shè)置

為比較化感物質(zhì)一次性暴露與多次暴露方式對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)一以壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸3種化感物質(zhì)為對(duì)象，參照72 h抑藻測(cè)試所得化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的有效抑制濃度，確定化感物質(zhì)暴露總量為2.5 mg·L-1。每種物質(zhì)設(shè)置2個(gè)處理組，其中單次暴露組在實(shí)驗(yàn)開始就一次性添加化感物質(zhì)，使其在藻液中的終質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1，多次暴露組則在實(shí)驗(yàn)開始后以2 h間隔分5次每次添加0.5 mg·L-1。

為研究化感物質(zhì)不同暴露頻次下的抑藻效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)二以壬酸為代表，設(shè)置4個(gè)處理組。組1為實(shí)驗(yàn)時(shí)按2.5 mg·L-1質(zhì)量濃度一次性投加；組2以2 h間隔分 2次投加，每次投加質(zhì)量濃度為 1.25 mg·L-1；組3以2 h間隔分5次投加，每次投加質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1；組4以2 h間隔分8次投加，每次投加質(zhì)量濃度為0.31 mg·L-1。每個(gè)處理組投加的壬酸總量均為2.5 mg·L-1。

為探討多次暴露方式下化感物質(zhì)添加劑量與抑藻效果間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)三選擇壬酸和N-苯基-1-萘胺 2種化感物質(zhì)為研究對(duì)象，每種物質(zhì)設(shè)置 3個(gè)多次暴露組，每次添加量分別為0.25、0.2和0.1 mg·L-1，均以1 h間隔分10次添加，得到暴露總量分別為2.5、2.0和1.0 mg·L-1。

為探討光暗條件對(duì)多次暴露化感物質(zhì)抑藻效果的影響，實(shí)驗(yàn)四選擇壬酸和N-苯基-1-萘胺2種化感物質(zhì)為研究對(duì)象，每種物質(zhì)均設(shè)置2個(gè)多次暴露組，分別于銅綠微囊藻的光培養(yǎng)階段和暗培養(yǎng)階段，以2 h間隔分5次每次添加0.5 mg·L-1投加化感物質(zhì)，暴露總量均為2.5 mg·L-1。

1.3 抑藻測(cè)試

參照ISO8692標(biāo)準(zhǔn)采用250 mL錐形瓶進(jìn)行抑藻測(cè)試，將一定量溶解在二甲亞砜中的壬酸或 N-苯基-1-萘胺或咖啡酸母液按實(shí)驗(yàn)設(shè)置添加到銅綠微囊藻培養(yǎng)液中。每種物質(zhì)的每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置 1個(gè)溶劑對(duì)照組，助溶劑二甲亞砜的含量與處理組相同，均為0.02%，該濃度的助溶劑不會(huì)影響銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。接種藻液起始密度為 1×106cells·mL-1，每次添加完錐形瓶均用透氣封口膜密封，置于光照培養(yǎng)箱在2000 lx，12 h∶12 h光暗比，(25±1) ℃的條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理和對(duì)照均設(shè)置3個(gè)平行。每天定時(shí)取樣測(cè)定對(duì)照和處理中的藻液光密度值（OD650）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分別用Microsoft Excel 2010和Origin Pro 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本分析和繪圖，不同處理之間的差異采用SPSS 13.0軟件中的單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量方差分析，多重比較采用Tukey檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單次與多次暴露化感物質(zhì)抑藻效果比較

2.5 mg·L-1的壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸均顯著抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)（圖1A, B, C）。在沒有添加化感物質(zhì)的對(duì)照組中，銅綠微囊藻從第 3天開始就進(jìn)入快速分裂階段，到第7天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，藻液光密度值仍在不斷升高?；形镔|(zhì)處理組，無論是單次暴露還是多次暴露，從第3天開始，藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組間呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05），銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到明顯抑制，顯示壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸較強(qiáng)的抑藻活性。壬酸和咖啡酸單次暴露組銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線從第 5天開始上升，而N-苯基-1-萘胺暴露組銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線直到第7天仍沒有明顯上升趨勢(shì)。說明N-苯基-1-萘胺對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的作用時(shí)效比相同劑量水平的壬酸和咖啡酸長(zhǎng)。

圖1 壬酸(A)、N-苯基-1-萘胺(B)和咖啡酸(C)單次和多次暴露下銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線(n=3)Fig. 1 Growth curves of M.aeruginosa exposed once and repeatedly to nonanoic acid (A), N-phenyl-1-naphthylamine (B) and caffeic acid (C) (n=3)

與單次暴露相比，壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸 3種化感物質(zhì)多次暴露對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。從第5天開始，多次暴露組與單次暴露組的銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)顯著差異。到第7天，壬酸、咖啡酸和 N-苯基-1-萘胺單次暴露組的平均藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為 27.76%、38.16%和72.46%，多次暴露組則依次為51.29%、60.39%和 80.92%。由此說明化感物質(zhì)低劑量多次暴露產(chǎn)生的抑藻效果比一次性高劑量暴露強(qiáng)，相比一次性暴露，低劑量多次暴露抑藻效應(yīng)更持久。

2.2 不同頻次暴露化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)

圖 2顯示不同暴露頻次下化感物質(zhì)壬酸對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制率，第3天到第7天，各個(gè)處理組的抑制率由小到大依次為組 1<組 2<組 4<組3<組5。組1為單次暴露組，對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的最高抑制率出現(xiàn)在第5天，為40.5%。其余3個(gè)多次暴露組的抑藻率均高于單次暴露組。組2、組3和組4的暴露間隔時(shí)間均為2 h，單次暴露量依次減少，暴露次數(shù)依次增多，而抑藻效果最好的是組3，第5天平均抑制率達(dá)到52.43%，而組2和組4第5天的平均抑制率分別為45.49%和47.99%，顯著低于組3（P<0.05）。

2.3 不同劑量多次暴露化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

由圖3可見，對(duì)照組銅綠微囊藻從第2天開始進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段，光密度值從0.1升高至第7天的0.6。2種物質(zhì)的3個(gè)處理組銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線均顯著緩于對(duì)照組，其抑制活性均隨著添加量的減少而降低。壬酸對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制程度隨添加量減少而明顯減弱。單次添加量0.25 mg·L-1的暴露組藻細(xì)胞停滯期延長(zhǎng)到第4天，第5天和第7天的抑制率分別為78.81%和63.74%；單次添加量0.2 mg·L-1的暴露組銅綠微囊藻生長(zhǎng)停滯期延長(zhǎng)至第3天，第5天和第7天抑制率分別為72.32%和41.36%；單次添加量0.1 mg·L-1的暴露組銅綠微囊藻的生長(zhǎng)也受到了抑制，但明顯沒有前兩個(gè)暴露組活性強(qiáng)，第3天抑制率僅為45.35%。隨著單次暴露劑量的降低，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)速率恢復(fù)得越來越快，0.2 mg·L-1暴露組在第6天抑制率開始降低，0.1 mg·L-1處理組從第5天抑制率就開始迅速降低。

圖2 不同暴露頻次下壬酸對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制率(n=3)Fig. 2 Growth inhibition ratio of M.aeruginosa exposed to nonanoic acid in different frequency (n=3)

圖3 壬酸(A)和N-苯基-1-萘胺(B)不同劑量多次暴露下銅綠微囊藻的生長(zhǎng)曲線(n=3)Fig. 3 Growth curves of M.aeruginosa repeatedly exposed to nonanoic acid (A) and N-phenyl-1-naphthylamine (B) at different concentrations (n=3)

添加總量2.5 mg·L-1的N-苯基-1-萘胺暴露組對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，到第7天光密度值僅為 0.13。以對(duì)照為本底計(jì)算該處理組第 3天、第 5天和第 7天的抑制率依次為 29.40%、73.34%和 79.68%。N-苯基-1-萘胺添加總量 2 mg·L-1的暴露組單次添加量為0.2 mg·L-1，對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)也有顯著抑制，停滯期延長(zhǎng)到第 4天，第 5天和第 7天抑制率分別為 58.28%和67.64%。總添加量降為1 mg·L-1時(shí)，單次添加量為0.1 mg·L-1的N-苯基-1-萘胺暴露組，相比前2個(gè)處理組，對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制程度有所降低，但與對(duì)照相比銅綠微囊藻的生長(zhǎng)仍受到明顯抑制，第5天和第7天抑制率分別達(dá)到49.42%和50.25%。

2.4 光照和黑暗階段多次暴露化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

如圖4所示，2種化感物質(zhì)在黑暗階段多次暴露對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制率顯著高于光照階段（P<0.05）。其中壬酸光照階段暴露組平均抑制率隨時(shí)間呈拋物線形式，從第1天到第4天逐漸上升，然后緩慢下降。而黑暗階段暴露組壬酸對(duì)銅綠微囊藻的平均生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，到第 7天達(dá)到63.64%。光照階段多次暴露的N-苯基-1-萘胺對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制活性隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，第 3天抑制率達(dá)到50.68%，第7天達(dá)到90.31%；黑暗階段多次暴露抑藻活性更強(qiáng)，第 3天抑制率達(dá)到67.89%，隨后一直升高，第7天達(dá)到91.13%。盡管N-苯基-1-萘胺表現(xiàn)出比壬酸更強(qiáng)的抑藻活性，但 2種物質(zhì)在黑暗階段多次暴露均比光照階段多次暴露能更好地抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)和自然水體中的原位實(shí)驗(yàn)均證實(shí)共存狀態(tài)下水生植物可以高效抑制藻類的生長(zhǎng)，而移走植物后沒有更新或補(bǔ)充的種植水對(duì)藻類的生長(zhǎng)影響卻不顯著（Nakai等，1999；Wu等，2007），造成這種差異最可能的原因就是后者不存在化感物質(zhì)的持續(xù)補(bǔ)充和累積。本研究中選擇了壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸 3種水生植物常見化感物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在顯著降低暴露劑量的情況下，分多次暴露的化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制效果不比高劑量單次暴露差，反而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制效應(yīng)。壬酸在沉水植物穗花狐尾藻和伊樂藻種植水中均有檢測(cè)到，為抑藻活性較高的一種脂肪酸類化感物質(zhì)（Nakai等，2005；Gao等，2014）。咖啡酸在沉水植物伊樂藻、苦草和輪葉黑藻體內(nèi)及其種植水中都有檢測(cè)到，是一種活性較強(qiáng)的酚酸類化感物質(zhì)（Gao等，2011，2014）。N-苯基-1-萘胺很早就從室內(nèi)培養(yǎng)和野外種植的鳳眼蓮分泌液中分離鑒定到（孫文浩等，1993），近期我們又從伊樂藻、輪葉黑藻和苦草種植水中檢測(cè)到，與其同系物N-苯基-2-萘胺一樣，具有較強(qiáng)的抑藻活性，屬于含氮化合物。不同來源、不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的 3種化感物質(zhì)均在低劑量多次暴露時(shí)表現(xiàn)出比高劑量單次暴露更強(qiáng)的抑藻效果，證實(shí)我們關(guān)于水生植物對(duì)藻類的化感抑制作用具有持續(xù)性和累積性的假設(shè)。

圖4 光照和黑暗階段多次暴露壬酸(A)和N-苯基-1-萘胺(B)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制率(n=3)Fig. 4 Growth inhibition ratio of M.aeruginosa repeatedly exposed to nonanoic acid (A) and N- phenyl-1-naphthylamine (B) under light and dark phase (n=3)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證多次暴露的抑藻作用，我們比較了不同頻次暴露壬酸對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用，結(jié)果顯示，無論是分2次、5次還是8次的多次暴露組，壬酸對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制率都顯著高于單次暴露組。而在多次暴露組中，抑藻效果的強(qiáng)弱與暴露次數(shù)、間隔時(shí)間和暴露劑量均有關(guān)。在固定間隔時(shí)間和暴露總量的情況下，壬酸抑藻效果并不總是隨著暴露次數(shù)的增加而加強(qiáng)，而是5次暴露強(qiáng)于8次暴露的抑藻效果。造成這種結(jié)果的主要原因可能與單次暴露劑量的降低有關(guān)，8次暴露間隔2 h每次暴露量?jī)H為0.31 mg·L-1。Lu等（2014）在研究焦性沒食子酸對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)若按每日1次的添加頻率，單次添加量必須在0.5 mg·L-1以上才能有效抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。當(dāng)我們將間隔時(shí)間縮短到1 h，單次暴露量即使降低到0.1 mg·L-1，壬酸和N-苯基-1-萘胺仍能實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的高效抑制。由此可見，在間隔時(shí)間一定時(shí)，單次暴露有效劑量也存在一個(gè)閾值。

事實(shí)上，劑量-效應(yīng)關(guān)系廣泛存在于水生植物及其化感物質(zhì)的抑藻作用中。暴露在 0.5、2.0和8.0 mg·L-1蘆竹堿中的銅綠微囊藻細(xì)胞密度分別為對(duì)照組的44%、4%和1%（Hong等，2009）。蘆葦化感抑藻物質(zhì) 2-甲基乙酰乙酯對(duì)三角褐指藻的抑制效果也隨著暴露濃度的增加而增強(qiáng)（Yang等，2011）。焦性沒食子酸對(duì)柱孢藻生長(zhǎng)、氧化脅迫和相關(guān)基因表達(dá)的影響均隨著暴露濃度的增加而增強(qiáng)（Wu等，2013）。壬酸和N-苯基-1-萘胺2種物質(zhì)不同劑量多次暴露的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，添加頻次一定，化感物質(zhì)的抑藻活性隨著單次添加劑量的減少而減弱。但是與高劑量單次暴露相比，單次添加劑量低至100 μg·L-1時(shí)的壬酸和N-苯基-1-萘胺仍能顯著抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，這個(gè)劑量已非常接近水生植物化感物質(zhì)的釋放量（Nakai等，2000；Gao等，2011）。這再次證明水生植物對(duì)藻類的有效抑制很有可能通過化感物質(zhì)在劑量和作用上的持續(xù)累積效應(yīng)實(shí)現(xiàn)。

光照是影響包括水生植物和藻類等光合生物生長(zhǎng)和代謝的一個(gè)重要因素。我們的前期研究顯示光照的強(qiáng)弱不僅影響水生植物的生長(zhǎng)和初生代謝，也會(huì)影響水生植物次生代謝產(chǎn)物的合成和釋放（葛芳杰等，2012）。低光照下穗花狐尾藻主要的酚酸特里馬素 II在植物組織中的含量比高光照下更高（Gross，2003）。穗花狐尾藻釋放的 5種酚酸和3種脂肪酸在低光照下對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制活性顯著高于高光照下的抑制活性（Nakai等，2014）。同時(shí)，自然水體中水生植物和藻類的生長(zhǎng)均會(huì)經(jīng)歷白天的光照階段和夜晚的黑暗階段。盡管已有的研究大都在植物光照階段開展，如對(duì)水生植物化感物質(zhì)釋放情況的分析以及抑藻活性測(cè)試中化感物質(zhì)的暴露等（Gao等，2011）。但關(guān)于自然水體中水生植物釋放化感物質(zhì)抑藻的階段目前仍不清楚?？紤]到水生植物在白天光照階段需要更多的能量用于植物的光合作用，而夜晚的黑暗階段有可能從呼吸作用釋放的能量中獲取更多用于次生代謝產(chǎn)物的合成（武維華，2012）。另外有些化感物質(zhì)具有光敏性，如焦酚，光照條件下很容易在水溶液中發(fā)生降解（Nakai等，2000）。我們?cè)O(shè)計(jì)了白天光照階段和夜晚黑暗階段分別多次暴露壬酸和 N-苯基-1-萘胺的抑藻實(shí)驗(yàn)，比較兩種條件下化感物質(zhì)多次暴露下對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，黑暗階段多次暴露化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。這可能與藻類等光合生物在光照階段和黑暗階段不同的生命活動(dòng)有關(guān)，黑暗階段化感物質(zhì)的多次暴露更容易對(duì)藻細(xì)胞的分裂生殖產(chǎn)生直接的影響。

4 結(jié)論

水生植物常見化感物質(zhì)壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸可以通過多次暴露實(shí)現(xiàn)低劑量水平下對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的高效抑制。在單次添加劑量為0.1 mg·L-1時(shí)壬酸和N-苯基-1-萘胺以1 h間隔分10次添加仍能顯著抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。在銅綠微囊藻生長(zhǎng)的黑暗階段比在光照階段多次暴露壬酸和N-苯基-1-萘胺的抑藻效果更強(qiáng)。研究結(jié)果將有助于揭示水生植物化感抑藻作用的生態(tài)機(jī)制，指導(dǎo)水生植物化感抑藻作用的實(shí)踐應(yīng)用。

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Comparative Study on Antialgal Effects of Allelochemicals from Aquatic Plants under Different Exposure Protocols

GAO Yunni1,2, GE Fangjie2, LIU Biyun2*, LU Zhiying2, HE Yan2, ZHANG Yongyuan2, WU Zhenbin2
1. College of Fisheries Henan Normal University, Xinxiang 453007, China; 2, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China

To explore the effective pathway of how the allelochemicals released by aquatic plants work at ecological levels, three typical allelochemicals including nonanoic acid, N-phenyl-1-naphthylamine and caffeic acid, from different chemical classes, were selected to compare their inhibition effects at high-dose single exposure and low-dose repeated exposure on the growth of Microcystis aeruginosa. The influences of exposure frequency, dose and light conditions on the repeated exposure effect were examined. Stronger inhibition on cyanobacterial growth was observed in the low-dose (0.5 mg·L-1) repeated exposure (five times at 2 h interval) group than that in the high-dose (2.5 mg·L-1) single exposure group. The inhibition ratio of nonanoic acid, N-phenyl-1-naphthylamine and caffeic acid in the former group was 1.8, 1.1 and 1.6 times that of the latter group on the 7thday. When nonanoic acid and N-phenyl-1-naphthylamine were repeatedly exposed 10 times at 1h interval, the cyanobacterial growth inhibition ratio decreased with the reduction of single dose. However, the growth of M.aeruginosa was significantly inhibited by the two allelochemicals when the single dose was as low as 0.1 mg·L-1, with an inhibition ratio up to 50.25% by N-phenyl-1-naphthylamine on the 7thday. The inhibition effects of nonanoic acid and N-phenyl-1-naphthylamine when repeatedly added under dark phase were stronger than that under light phase, the cyanobacterial growth inhibition ratio of the former group was 2.2 and 1.3 times that of the latter group on the 3rdday. All above results indicated that the allelochemicals released by aquatic plants could exert more effective inhibition on the growth of M.aeruginosa by low-dose repeated exposure than high-dose single exposure. Hence, further study on the antialgal effects of plant allelochemicals through repeated exposure would be helpful for revealing allelopathy mechanism of aquatic plants in natural environments, and guiding their theoretical research and practical application.

nonanoic acid; N-phenyl-1-naphthylamine; caffeic acid; repeated exposure; Microcystis aeruginosa

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.04.002

X173

A

1674-5906（2015）04-0554-07

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國(guó)家“十二五”水專項(xiàng)（2012ZX07101007-005）；國(guó)家“十二五”科技支撐項(xiàng)目（2012BAJ21B03）；淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2013FB20）；淡水生態(tài)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2015FB02）；河南師范大學(xué)博士啟動(dòng)課題（qd14179）

高云霓（1982年生），女（土家族），副教授，博士，主要研究方向?yàn)榈h(huán)境的化學(xué)生態(tài)學(xué)。E-mail: gaoyn@htu.cn *通信作者：劉碧云（1971年生），女，副研究員，博士。E-mail: liuby@ihb.ac.cn

2015-02-03