馬宇霆，王 丹，王瑞平，鄒 璽

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院（南京 210023）；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（南京 210023）；3.江蘇省中醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科（南京 210029）

結(jié)腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢［1］。鄒璽等［2］認(rèn)為結(jié)腸癌的病機(jī)以脾氣虛弱、瘀毒內(nèi)結(jié)為主，治法以健脾化濕、活血化瘀為主，并自擬以健脾化瘀法為主的中藥煎劑辨證治療各證型結(jié)腸癌。前期研究［3］發(fā)現(xiàn)，健脾化瘀方對人肝癌HepG2細(xì)胞、結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞、人胃癌SGC－7901細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力有明顯抑制作用。越來越多的證據(jù)表明缺氧普遍存在于人類腫瘤中，隨著實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展，腫瘤內(nèi)部不能得到足夠的血液供應(yīng)，導(dǎo)致局部處于缺血缺氧狀態(tài)，使腫瘤組織內(nèi)局部氧分壓改變［4－5］。目前，惡性腫瘤病死率仍較高，常見的手術(shù)、放化療及靶向治療等方法均未能取得突破性進(jìn)展，其原因主要是腫瘤細(xì)胞具有無限增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。本實(shí)驗(yàn)采用CoCl2刺激結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，模擬腫瘤體內(nèi)缺氧微環(huán)境，觀察健脾化瘀方對缺氧微環(huán)境下SW480細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

健脾化瘀方［6］：白術(shù)10g、地錦草15g、丹參15g、蚤休15g、莪術(shù)10g、半枝蓮30g、茵陳15g，用1 100mL超純水加熱回流提取2次，合并藥液進(jìn)行濃縮處理，微波真空干燥，高溫高壓滅菌，配制成相當(dāng)于生藥濃度0.8g/mL的水提液，再用完全培養(yǎng)液稀釋為0.2、0.4、0.8mg/mL，22μm微孔濾膜過濾。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RPMI－1640培養(yǎng)基購自南京凱基生物技術(shù)公司，氯化鈷六水合物、胰蛋白酶粉、PBS粉購自美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司，MTT粉劑購自Biosharp公司，二甲基亞砜（DMSO）分析純購自成都科隆化學(xué)品有限公司，F(xiàn)N膠和Matrigel膠購自美國密理博（Millipore）公司。

結(jié)腸癌SW480細(xì)胞購自南京凱基生物公司，用含10%胎牛血清及1%雙抗的1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)［6］。

1.2 方法

1.2.1 健脾化瘀方對缺氧條件下SW480細(xì)胞增殖能力的影響 采用MTT法測定，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。實(shí)驗(yàn)分為空白組、CoCl2組、健脾化瘀方不同濃度（0.2、0.4、0.8mg/mL）處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以6×103個(gè)/mL接種于96孔板，100μL/孔，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)液，空白組每孔加入200μL完全培養(yǎng)液，其余4組均加入同等劑量的CoCl2，使其終濃度為200μmol/L，健脾化瘀方不同濃度組加入適量健脾化瘀方，使其終濃度為0.2、0.4、0.8mg/mL。常規(guī)培養(yǎng)24h后，用PBS溶液小心清洗每孔3遍，將96孔板倒置于吸水紙上，吸干PBS溶液后，于每孔加入100μL 1640完全培養(yǎng)液和20μL MTT溶液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，吸去所有上清液，每孔加入150μL DMSO，水平振蕩器避光振蕩10min，使用酶標(biāo)儀于波長490nm處測定各孔吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞抑制率［7－8］。抑制率（%）＝［1－（給藥組A490值－空白組A490值）/（CoCl2組A490值－空白組A490值）］×100%。

1.2.2 健脾化瘀方對缺氧條件下SW480細(xì)胞黏附能力的影響 分組同上。取對數(shù)期細(xì)胞，消化，離心（離心半徑6cm，800r/min，離心5min），并重懸于完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/孔，接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，給藥，具體給藥方式同1.2.1；繼續(xù)培養(yǎng)30、60、90、120min。酶標(biāo)儀測定490nm波長處各孔A值，觀察健脾化瘀方對缺氧微環(huán)境下的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞黏附能力的影響［9］。

1.2.3 健脾化瘀方對缺氧條件下SW480細(xì)胞侵襲能力的影響 分組同上。Matrigel膠和超純水按1∶9稀釋，并予50μL均勻平鋪于每個(gè)Transwell小室底部，4℃風(fēng)干過夜，待用。取對數(shù)期細(xì)胞，將培養(yǎng)皿中原有培養(yǎng)液棄去，換成含1%小牛血清的1640培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞12h后，給藥，具體給藥方式同1.2.1。常規(guī)培養(yǎng)24h后，收集空白組皿中上清液，作為條件培養(yǎng)液，同時(shí)消化各組細(xì)胞，離心（離心半徑6cm，800r/min，離心5min）計(jì)數(shù)，維持細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，用含1%小牛血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，每個(gè)上室加入約250μL細(xì)胞懸液，再向下室中加入300μL完全培養(yǎng)液，以及300μL條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后取出小室，吸去小室上室中的培養(yǎng)液，倒置小室，通風(fēng)處風(fēng)干，再用75%乙醇固定細(xì)胞，待自然風(fēng)干后，用臺盼藍(lán)溶液對于穿透小室的細(xì)胞染色，自然風(fēng)干。取出小室基底膜，載玻片固定，倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野，記錄由小室遷移至基底膜下的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞侵襲抑制率，對各組侵襲細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)各組差異，侵襲抑制率＝［（CoCl2組穿膜細(xì)胞數(shù)－健脾化瘀方不同濃度處理組穿膜細(xì)胞數(shù)）/CoCl2組穿膜細(xì)胞數(shù)］×100%［10］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析比較組間差異，進(jìn)一步采用SNK法進(jìn)行兩兩比較；定性資料采用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)分析組間差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測健脾化瘀方對缺氧SW480細(xì)胞增殖能力的影響

與空白組比較，缺氧條件下的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480增殖能力明顯下降，24h時(shí)，健脾化瘀方各濃度組對缺氧下的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的增殖有不同程度的抑制作用，但與CoCl2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；48h時(shí)，健脾化瘀方濃度為0.4、0.8mg/mL時(shí)，與 CoCl2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

表1 健脾化瘀方對缺氧SW480細(xì)胞增殖能力的影響（±s，%）

表1 健脾化瘀方對缺氧SW480細(xì)胞增殖能力的影響（±s，%）

注：與CoCl2組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別24h A 抑制率CoCl2＋復(fù)方0.8 0.65±0.12 54.55±4.53 0.57±0.11 66.07±6.68值 抑制率48h A 值＊＊CoCl2＋復(fù)方0.4 0.70±0.10 51.05±4.64 0.61±0.20 63.69±5.26＊CoCl2＋復(fù)方0.2 0.74±0.06 48.25±2.96 0.66±0.19 60.71±4.89 CoCl2 組 0.78±0.08 45.45±2.43 0.91±0.12 45.83±2.13空白組 1.43±0.11 － 1.68±0.14 －

2.2 MTT法檢測健脾化瘀方對缺氧SW480細(xì)胞黏附能力的影響

CoCl2組較空白組黏附能力明顯增強(qiáng)，且隨時(shí)間增加而增強(qiáng)；各濃度健脾化瘀方作用于缺氧SW480細(xì)胞后，其黏附能力較CoCl2組減弱（P＜0.05，P＜0.01），且其黏附抑制能力隨作用時(shí)間延長而逐漸增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01）（表2）。

表2 健脾化瘀方對缺氧SW480細(xì)胞黏附能力的影響（±s，%）

表2 健脾化瘀方對缺氧SW480細(xì)胞黏附能力的影響（±s，%）

注：與CoCl2組比較，＊P＜0.05；與CoCl2＋復(fù)方0.2組比較，＃P＜0.01；與CoCl2＋復(fù)方0.4組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

抑制率CoCl2＋復(fù)方0.8 0.79±0.10 52.16±3.26＊＃△△ 0.83±0.06 55.89±5.56＊?！?0.89±0.08 62.44±6.13＊?！?0.83±0.08 70.25±7.41＊?！鹘M別30min A 值 抑制率60min A 值 抑制率90min A 值 抑制率120min A 值CoCl2＋復(fù)方0.4 1.23±0.12 24.68±3.83＊＃ 1.34±0.07 29.28±3.22＊＃ 1.44±0.07 37.87±4.32＊ 1.41±0.10 48.74±5.13＊＃CoCl2＋復(fù)方0.2 1.51±0.06 7.93±2.14＊ 1.59±0.08 15.31±2.81＊ 1.73±0.09 24.81±3.75＊ 1.87±0.11 32.16±4.37＊CoCl2 組 1.64±0.15 －20.16±1.36 1.88±0.21 －22.86±2.3 2.32±0.35 －25.29±1.41 2.73±0.40 －25.83±1.86空白組 1.36±0.11 － 1.53±0.15 － 1.85±0.22 － 2.17±0.17 －

2.3 Transwell小室法檢測健脾化瘀方對缺氧SW480細(xì)胞侵襲能力的影響

CoCl2組較空白組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.01），各濃度的健脾化瘀方均能抑制SW480細(xì)胞的體外侵襲能力，各濃度組穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)隨健脾化瘀方濃度的增大而減少，侵襲抑制率增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表3）。

表3 健脾化瘀方對缺氧SW480細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

缺氧是腫瘤組織發(fā)展到一定階段后的生存狀態(tài)，是影響腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的重要因素［11］。已有研究［12－14］表明，缺氧不僅能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，還能夠調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，促進(jìn)代謝和轉(zhuǎn)移侵襲。本研究采用CoCl2處理SW480細(xì)胞，模擬腫瘤體內(nèi)缺氧環(huán)境，觀察健脾化瘀方對SW480細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

健脾化瘀方在臨床治療結(jié)腸癌中已取得一定療效［15］。本研究表明，在化學(xué)模擬缺氧微環(huán)境下，結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖能力受到明顯抑制，健脾化瘀方作用于缺氧微環(huán)境下的SW480細(xì)胞時(shí)，隨健脾化瘀方濃度及作用時(shí)間的增加，其增殖抑制率升高，當(dāng)藥物濃度達(dá)到0.8mg/mL時(shí)，其抑制率最高；缺氧微環(huán)境下腫瘤細(xì)胞的黏附能力增強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性明顯增加，不同濃度健脾化瘀方均具有抑制缺氧誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480黏附能力的作用，高濃度健脾化瘀方的黏附抑制能力明顯高于低濃度，且隨時(shí)間的延長，其黏附抑制能力有逐漸增強(qiáng)的趨勢；缺氧環(huán)境下的SW480細(xì)胞侵襲能力較空白組明顯增強(qiáng)，健脾化瘀方作用于缺氧誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480后，其侵襲能力明顯減弱，且隨著健脾化瘀方濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。綜上所述，健脾化瘀方在體外可明顯抑制缺氧微環(huán)境下SW480細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，呈一定的濃度依賴性，其具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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