文│崔?。ㄉ綎|省臨朐縣檢驗(yàn)檢測中心）

雞新城疫病原學(xué)及疫苗研究進(jìn)展

文│崔?。ㄉ綎|省臨朐縣檢驗(yàn)檢測中心）

雞新城疫（Newcastle Disease，ND）又稱為亞洲雞瘟、偽雞瘟，我國俗稱雞瘟，是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一種主要侵害雞和火雞的急性、高度接觸性和高度毀滅性的禽類烈性傳染病。強(qiáng)毒感染易感禽在臨床上常呈敗血性經(jīng)過，主要特征是呼吸困難、下痢、神經(jīng)機(jī)能紊亂、黏膜和漿膜出血。本病發(fā)病急、致死率高，經(jīng)常給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為A類動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。

ND于1926年首次發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞的爪哇島，同年發(fā)現(xiàn)于英國紐卡斯?fàn)柺校∟ewcastle），1927年Doyle首次分離到病原，根據(jù)發(fā)現(xiàn)地名命名為新城疫，經(jīng)過30多年時(shí)間傳播到世界各地。我國于1928年有類似本病的記錄，1935年發(fā)生地方性流行。1946年，梁英和馬聞天第一次報(bào)道在1935年發(fā)病的病料中分離到新城疫病毒，從而確認(rèn)本病在我國的存在。

ND傳播迅速，死亡率高，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。最近幾年除雞發(fā)生本病外，過去很少出現(xiàn)臨床癥狀的鴨、鵝等水禽和其他經(jīng)濟(jì)禽類以及鳥類發(fā)生新城疫的報(bào)道也逐年增加，并引起了國內(nèi)外專家學(xué)者的重視和不斷深入研究。本文著重對(duì)新城疫的病原學(xué)、毒力演化以及疫苗研究近況等方面進(jìn)行綜述。

一、病原學(xué)

1.NDV的一般生物學(xué)特性。

NDV為副粘病毒科腮腺炎病毒屬。NDV完整病毒粒子近圓形，直徑為10～250納米。但常因囊膜破損而形態(tài)不規(guī)則，也常見橫斷直徑為100納米左右的不同長度的細(xì)絲。有囊膜，在囊膜的外層有呈放射狀排列的纖突，能刺激宿主產(chǎn)生抑制病毒凝集紅細(xì)胞的抗體和病毒中和抗體。

病毒核酸類型為單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA，基因組是由15186或15192個(gè)核苷酸構(gòu)成，在NDV基因組上依次排列著NP、P、M、F、HN和L基因，分別編碼核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）和大分子蛋白（L）。

盡管病毒在宿主體外生存受環(huán)境溫度、濕度、陽光和病毒數(shù)量、毒株種類、貯存條件及是否存在有機(jī)物等多種因素的影響，總體而言NDV對(duì)理化因素的抵抗力比較強(qiáng)。NDV在pH3～10時(shí)不被破壞，真空凍干病毒30℃可存活30天，在4℃幾周、-20℃幾個(gè)月、-70℃幾年后仍能保持感染力。但NDV對(duì)消毒劑、高溫及紫外線較敏感，在直射陽光下經(jīng)30分鐘即可死亡。一般消毒劑常用濃度殺毒效果良好，如5%漂白粉、1%氫氧化鈉、70%酒精20分鐘即可將NDV殺死。

2.NDV的生物學(xué)活性。

（1）血凝活性（HA）。NDV的血凝活性是由于其囊膜表面的HN糖蛋白與紅細(xì)胞的表面受體結(jié)合所引起的。NDV可凝集所有兩棲類、爬行類、禽類及小鼠、豚鼠的紅細(xì)胞，但凝集牛、綿羊、山羊、豬、馬及人O型血紅細(xì)胞的能力則隨毒株的不同而有變化。利用這一特性，用雞的紅細(xì)胞做HA試驗(yàn)，并結(jié)合抗血清的特異性抑制作用（即HI試驗(yàn)）可診斷ND的發(fā)生和監(jiān)測免疫狀況。

（2）神經(jīng)氨酸酶活性（NA）。神經(jīng)氨酸酶（黏多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸水解酶）是HN蛋白的一部分，該酶的作用是可將病毒逐漸從紅細(xì)胞上洗脫下來，還可作用于受體位點(diǎn)，使F蛋白充分接近細(xì)胞而發(fā)生病毒與細(xì)胞的膜融合。

（3）細(xì)胞融合與溶血活性。NDV可引起紅細(xì)胞溶解或與其他細(xì)胞融合。病毒復(fù)制時(shí)附著于受體位點(diǎn)，隨后引起病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合，進(jìn)而導(dǎo)致兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的融合，該活性也可被特異性抗血清抑制。

（4）其他活性。最近的研究發(fā)現(xiàn)，NDV除了有誘導(dǎo)干擾素生成的作用，還有抗腫瘤免疫、引起細(xì)胞凋亡的作用。研究顯示，NDV能選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)人的成纖維細(xì)胞沒有殺傷作用。許多人類的腫瘤細(xì)胞都能高效地被NDV感染，并通過腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行自我復(fù)制，這種增殖與復(fù)制無傳染性。Schinmmacher等發(fā)現(xiàn)NDV有促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗腫瘤活動(dòng)的能力，誘導(dǎo)出現(xiàn)抗腫瘤白細(xì)胞聚集和抗腫瘤細(xì)胞毒作用以及誘導(dǎo)腫瘤壞死因子（TNF）的表達(dá)，還可抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長。

3.NDV的結(jié)構(gòu)蛋白及其功能。

研究表明，HN、F兩種糖蛋白是構(gòu)成NDV致病性的分子基礎(chǔ)。F蛋白分子量為59千道爾頓，由553個(gè)氨基酸組成，以羧基端嵌合在病毒囊膜上，具有使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合、導(dǎo)致病毒進(jìn)入細(xì)胞和溶血的作用。

HN糖蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，在病毒侵染過程中的作用是識(shí)別細(xì)胞受體、介導(dǎo)病毒吸附于靶細(xì)胞膜上的唾液酸受體而啟動(dòng)感染過程以及在病毒復(fù)制周期中加強(qiáng)病毒顆粒的移動(dòng)和促進(jìn)從感染細(xì)胞中釋放。

4.NDV的基因型、致病型和抗原型。NDV只有一個(gè)血清型，使用傳統(tǒng)的試驗(yàn)手段對(duì)NDV不同毒株的差異性分析只能采用毒力、蝕斑形成能力測定或單克隆抗體技術(shù)等試驗(yàn)來進(jìn)行，但如此分型存在一些局限性，使得NDV流行病學(xué)研究一直難以突破。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，Ballagi等最早在分子水平上對(duì)不同的NDV毒株進(jìn)行差異性分析，從而進(jìn)行基因分型的方法。

方法一是應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴(kuò)增NDVF基因全長75%的片段（即334-1682nt位核苷酸片段），通過對(duì)擴(kuò)增片段的核酸序列分析和3種限制性內(nèi)切酶（HinfI、Bst0I、Rsal）的酶切位點(diǎn)的分布情況分析，將NDV毒株進(jìn)行基因分型。

方法二是應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增NDVF基因高變區(qū)，即47-420nt（ORF的1-374nt）位基因片段，對(duì)該片段進(jìn)行核酸序列測定，然后繪制遺傳進(jìn)化樹，確定NDV的分型。遺傳進(jìn)化樹分析和酶切圖譜分析反映的NDV毒株之間的遺傳關(guān)系相當(dāng)一致。

依據(jù)這種方法，目前可以將NDV分為10個(gè)基因型，NDV也顯現(xiàn)出一定的遺傳演化規(guī)律，新城疫的每一次大流行都會(huì)有新的基因型出現(xiàn)，并且以新基因型為主。

二、NDV的演化與遺傳進(jìn)化

1.世界ND的流行。綜合近十年來的研究發(fā)現(xiàn)，NDV并沒有出現(xiàn)超強(qiáng)毒株，但是在強(qiáng)大的疫苗免疫壓力和用藥環(huán)境之下，NDV毒株呈現(xiàn)出毒力逐漸增強(qiáng)而引發(fā)疾病的現(xiàn)象，尤其是近年來導(dǎo)致水禽發(fā)病。綜合國內(nèi)外有關(guān)NDV毒力的變化和新城疫在全球的發(fā)生，共有過3次大流行。

第一次是于1926年起源于東南亞，經(jīng)亞洲向歐洲的緩慢傳播，經(jīng)30年傳播到世界各地。研究證實(shí)，20世紀(jì)30至50年代世界上ND的大流行主要由基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型NDV引起。第二次大流行于20世紀(jì)60年代末，起始于中東，至1973年就已波及大多數(shù)國家。這次大流行之所以傳播如此迅速，是由于家禽飼養(yǎng)方式的變革及大規(guī)模國際貿(mào)易造成的。此次大流行主要由基因Ⅳ和Ⅴ型所致。第三次大流行的暴發(fā)于70年代末起源于中東，發(fā)病雞主要為神經(jīng)型，無呼吸道癥狀，1981年到達(dá)歐洲后迅速蔓延到世界各地，主要由基因Ⅴ、Ⅵ型引起。

20世紀(jì)90年代以來，雖然沒有出現(xiàn)世界性的大流行，但局部地區(qū)的流行和爆發(fā)時(shí)常發(fā)生，此時(shí)期的NDV主要以基因Ⅶ型為主。而且此時(shí)新城疫的發(fā)生均出現(xiàn)在免疫雞群中，死亡率不是很高，但由于造成生產(chǎn)性能的降低，所造成的損失仍然十分嚴(yán)重。

2.我國ND的流行特點(diǎn)。進(jìn)入20世紀(jì)80年代中后期，我國ND的流行呈現(xiàn)出了一些新的特點(diǎn)：

（1）非典型ND已經(jīng)成為ND流行的主要形式。往往發(fā)生于免疫雞群；發(fā)病時(shí)間主要集中在免疫前后，同時(shí)也有相當(dāng)數(shù)量的雞群發(fā)病日齡提前，甚至10日齡以前就有雞只發(fā)?。涣餍械姆绞揭缘胤叫陨l(fā)或小規(guī)模流行為主，多發(fā)于冬春兩季；病雞的臨床表現(xiàn)和病理變化差異很大，多不具有典型的消化道癥狀。病程較長，發(fā)病率高低不等，死亡率不高，但對(duì)雞群的生產(chǎn)性能影響較大。

（2）鴨、鵝等水禽中出現(xiàn)了致病性強(qiáng)的NDV。以往認(rèn)為水禽和其他禽類抵抗力甚強(qiáng)，即使強(qiáng)毒株感染水禽也不表現(xiàn)癥狀。然而，近年在我國水禽飼養(yǎng)密集地區(qū)，由NDV引起鴨的發(fā)病及鵝的死亡越來越普遍。這可能表明，出現(xiàn)了對(duì)水禽特別是鵝呈高致病力的致病型。研究表明它屬于基因Ⅶ型，對(duì)雞亦是高致病性的，而且在抗原性上顯示出與經(jīng)典的NDV存在明顯差異。

近十年來，我國學(xué)者對(duì)國內(nèi)NDV的分子流行病學(xué)進(jìn)行了大量調(diào)查研究，綜合這些文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)90年代以來我國新城疫的流行情況與世界的流行趨勢(shì)相符，但同時(shí)又有自身的特點(diǎn)，雖然主要以基因Ⅶ型為主，但其他老基因型也一直存在。基因Ⅶd型和基因Ⅶe型是我國近年來的優(yōu)勢(shì)流行株，而基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型在我國不同的地區(qū)仍然存在，這些老基因型的存在增加了我國對(duì)NDV研究的復(fù)雜性。

在流行毒株方面同樣也是有著明顯規(guī)律，除了第三次大流行中的基因Ⅵ型以外，基因Ⅶ型是遍及全世界的流行毒株，是分布和出現(xiàn)幾率最高的基因型。而在中國除了這兩種基因型以外，還有一種與基因Ⅲ型關(guān)系較近的、我國特有的基因Ⅸ型的流行。

三、ND疫苗

目前，ND疫苗的種類較多，不同種類的疫苗免疫性能、免疫方法不同，主要有活苗、滅活苗和基因工程疫苗。

1.活苗。目前我國常用的活疫苗有兩大類：中等毒力的I系和弱毒的Ⅱ系、Ⅲ系和Ⅳ系。

中等毒力Ⅰ系疫苗，如Mukteswar株（Ⅰ系）、Roakin株、Komorov株和Hertfordshire株（Herts33）等，免疫原性強(qiáng)，中等毒力，只適用于1月齡以上的雞，對(duì)幼雛有一定的致病性，產(chǎn)生的免疫力持久。

Ⅱ系苗，可用于首免和加強(qiáng)免疫，接種方法可噴霧、點(diǎn)眼、滴鼻、飲水和注射，目前多用于種雞首免。

Ⅲ系（也稱F系）苗，毒力介于Ⅱ系和Ⅳ系之間，可用于7日齡以上雞的免疫，目前應(yīng)用較少。

Ⅳ系苗的毒力和免疫原性都比Ⅱ系稍強(qiáng)，代表株為LaSota株，適用于任何日齡的雞，也是目前應(yīng)用最多的弱毒疫苗毒株。一般用于7日齡以上雞的首免和加強(qiáng)免疫。

另外，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和單克隆技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞苗和克隆苗也越來越多地被應(yīng)用。如Clone-30弱毒苗、單克隆N-79型LaSota弱毒株、克隆-83等，其特點(diǎn)是毒力低、免疫源性好，可用于具有較高母源抗體的雛雞。

活疫苗成本低廉，操作方便，能快速產(chǎn)生局部免疫，便于大群免疫，能同時(shí)刺激產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫效果好，因此在世界許多國家被廣泛用來防治新城疫。

但是弱毒疫苗和中等毒力疫苗可在雞呼吸道復(fù)制，引起溫和的病變，其也存在毒力可能返強(qiáng)、散毒風(fēng)險(xiǎn)，中等毒力毒株也可能對(duì)免疫雞引起接種反應(yīng)，安全性受到質(zhì)疑。

2.滅活疫苗。滅活疫苗不存在安全性問題，可引起堅(jiān)強(qiáng)而持久的免疫力。常用的滅活疫苗是油佐劑滅活苗，最常用于蛋雞和種雞，但是因?yàn)槠洚a(chǎn)生免疫力的時(shí)間較長，雛雞使用時(shí)應(yīng)配合弱毒活疫苗同時(shí)使用。

滅活疫苗是用物理或化學(xué)方法滅活病毒獲得疫苗抗原，并用佐劑乳化成的疫苗。因使用已滅活的抗原，所以安全性好。目前新城疫白油佐劑滅活疫苗應(yīng)用較為廣泛，直到目前仍然被當(dāng)作重要的免疫預(yù)防疫苗。無論滅活疫苗還是活疫苗免疫預(yù)防新城疫，必須制定合理的免疫程序，才能發(fā)揮疫苗最大效力保證抵抗病毒攻擊。

3.基因工程疫苗。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)上的發(fā)展，體外重組DNA技術(shù)使得NDV基因工程疫苗的研制成為研究熱點(diǎn)。從80年代末至今，已有多種NDV毒株的糖蛋白F和（或）HN基因在多種病毒載體上得到表達(dá)，制備出重組活載體疫苗或亞單位疫苗。

桿狀病毒載體系統(tǒng)是研制NDV亞單位苗的主要工具。迄今為止，已有NDV B1株、Hitchner株、Miyadera株、D26株的HN和F基因在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)。用感染重組桿狀病毒的家蠶或組織細(xì)胞加工制備成的油佐劑疫苗免疫試驗(yàn)雞，能抵抗強(qiáng)毒的攻擊。

在重組雞痘病毒載體中，不論是單獨(dú)表達(dá)F或HN糖蛋白之一，還是共同表達(dá)F和HN糖蛋白，都能使被其免疫的無特定病原體（SPF）雞產(chǎn)生對(duì)NDV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)作用，這種保護(hù)力至少維持8周。Taylor等發(fā)現(xiàn)，表達(dá)F的重組雞痘病毒肌肉或皮下接種優(yōu)于口服或滴鼻免疫，產(chǎn)生抗體的過程快而且水平高，能夠產(chǎn)生完全保護(hù)。

美國農(nóng)業(yè)部于1995年正式批準(zhǔn)了第一個(gè)重組雞痘病毒活載體疫苗-VectorVAXFP-N的商品化，該重組活疫苗免疫效果與常規(guī)ND疫苗相當(dāng)，并且一次免疫即可保護(hù)雞抵抗NDV強(qiáng)毒的攻擊。同時(shí)，Wolff、Scanlon、Gorman、Hodder及我國學(xué)者陳洪巖等在基因疫苗、抗獨(dú)特型抗體疫苗的研制方面都曾進(jìn)行了有益探索，并取得了一定的進(jìn)展。

由于傳統(tǒng)疫苗在安全性、穩(wěn)定性及免疫原性等方面存在一些不足，許多學(xué)者都致力于研制更為安全有效的疫苗。基因工程疫苗具有毒性低、免疫源性好、生產(chǎn)成本低、利于大批量生產(chǎn)、易于區(qū)分自然感染與免疫感染及便于診斷的優(yōu)點(diǎn)，是今后ND疫苗發(fā)展的方向。