趙峰,劉國民,李娟玲*,張恩華,張其文,符偉

1.海南廣播電視大學(xué),海南海口570208

2.海南大學(xué)苦丁茶研究所,海南海口570228

應(yīng)用RAPD技術(shù)分析女貞種質(zhì)資源的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)

趙峰1,劉國民2,李娟玲2*,張恩華2,張其文2,符偉2

1.海南廣播電視大學(xué),海南?？?70208

2.海南大學(xué)苦丁茶研究所,海南?？?70228

本研究采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)我國7個(gè)野生居群共121份女貞種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。10條有效引物對(duì)121份女貞種質(zhì)材料進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出94條DNA譜帶，其中80條為多態(tài)性帶，占總擴(kuò)增帶數(shù)的85.11%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出9.4條譜帶。分析結(jié)果表明，供試女貞材料在物種水平上具有豐富的遺傳多樣性，有效等位基因數(shù)Ne=1.4344，Nei’s基因多樣性H=0.2591，Shannon信息指數(shù)I=0.3959；但在居群水平上，女貞的遺傳多樣性水平較低，PPB=37.08%，Ne=1.2590，H=0.1455，I=0.2127。女貞居群內(nèi)的遺傳變異大于居群間的遺傳變異，居群間遺傳分化指數(shù)Gst=0.4067，總的遺傳變異中有40.67%的變異存在居群間，有59.33%的遺傳變異存在于居群內(nèi)。女貞居群間基因交流有限，基因流(Nm)為0.7294＜1。

女貞;種質(zhì)資源;遺傳多樣性;RAPD

女貞(Ligustrum lucidum Ait)系木犀科(Oleaceae)女貞屬(Ligustrum）常綠灌木或小喬木，具有清熱解毒，抗菌消炎，健胃消積，去膩醒酒，止咳化痰，生津止渴，提神醒目明目益智和抗輻射，抗衰老，活血脈，強(qiáng)心利尿，降壓減肥，抑癌防癌，調(diào)節(jié)血脂等功效[1]。女貞是木犀科苦丁茶之重要種類之一，是一種珍貴的茶藥兩用植物，具有多種藥用價(jià)值和保健功能。女貞主要功能成份有多糖類、三萜類、黃酮類、苯醇類、磷脂類等化合物[2-15]，對(duì)紅細(xì)胞造血有促進(jìn)作用，能加快血小板的流動(dòng)性，減弱血小板之間的碰撞，使其不易粘連和聚集，更不易在血管內(nèi)膜沉積，從而減緩和防止血栓形成，又可降低脂質(zhì)內(nèi)膜的沉積，改善老年人血小板的流動(dòng)性，降低血液粘度，防治老年人的血栓性疾病和動(dòng)脈粥樣硬化[16]。

RAPD標(biāo)記（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）是Williams和Welsh等于1990年利用PCR技術(shù)發(fā)展起來的一種DNA多態(tài)性標(biāo)記。它是建立在PCR(Polymerase Chain Reaction)基礎(chǔ)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子標(biāo)記技術(shù)。其以基因組DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(通常為10個(gè)堿基對(duì))為引物,在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、EB(溴化乙錠)染色后，在紫外透視儀上檢測(cè)多態(tài)性。RAPD技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性、品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系等研究領(lǐng)域，但在女貞種質(zhì)材料的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)等方面，目前未見有前人的研究報(bào)道。本研究采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，選取我國7個(gè)居群中的121份女貞種質(zhì)材料，從DNA分子水平上探討女貞種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及遺傳多樣性。旨在通過這一工作為更加科學(xué)合理地保護(hù)與開發(fā)利用女貞種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料來源

從海南大學(xué)苦丁茶研究所種質(zhì)資源圃收集的7個(gè)居群121份種質(zhì)材料上，分別取嫩葉或嫩芽作為本實(shí)驗(yàn)的供試材料（表1）。

表1　用于RAPD分析的121份女貞種質(zhì)材料及其來源Table 1 121 germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait used for RAPD along with their origins

1.2方法

1.2.1總DNA的提取采用李娟玲[17]等的改良CTAB法提取121份女貞種質(zhì)材料基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA的完整性；稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定230 nm、260 nm和280 nm的吸光度，即OD值，計(jì)算所提DNA的濃度及估測(cè)DNA的純度。

1.2.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)在icyclerTMThermal Cycler型PCR儀上進(jìn)行。采用優(yōu)化后的RAPD反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，即：每25 μL體積中，10×反應(yīng)buffer 2.5 μL，25 mM的MgCl23.0 μL，0.5 μL dNTPs，Taq酶0.4 μL，引物1.0 μL，DNA模板2.5 μL。Taq DNA polymerase和4×dNTP mix均購自上海申能博彩生物科技有限公司，Operon系列引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成(表2)。

RAPD-PCR擴(kuò)增程序94℃預(yù)變性4 min，然后按94℃變性30 s，38℃退火45 s，72℃延伸120 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，16℃保存。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)一次。

1.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色，在Gel Doc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)下照相并記錄。以100 bp plus DNA Ladder（購自中科瑞泰北京生物科技有限公司）作為對(duì)照分子量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4PCR擴(kuò)增譜帶的統(tǒng)計(jì)和分析將電泳圖譜上清晰且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒有條帶記為“0”由此生成0和1原始矩陣，統(tǒng)計(jì)每個(gè)引物擴(kuò)增出的總帶數(shù)和其中的多態(tài)性帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)性帶百分率（Percentage of polymorphic bands，PPB），PPB=多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)。用NTSYS-PC(2.02j)軟件中的SIMQUAL程序計(jì)算Jaccard遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity，GS)[18]，并獲得遺傳相似系數(shù)矩陣。計(jì)算公式：GSij=2Nij/(Ni+Nj)，式中Nij指兩個(gè)個(gè)體間共有的帶數(shù)，Ni+Nj指兩個(gè)個(gè)體所有帶數(shù)之和；用NTSYS-PC(2.02j)軟件中的SAHN程序和UPGMA(Unweighted pair group mean average)方法進(jìn)行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成系統(tǒng)樹圖。

應(yīng)用POPGENE1.31軟件在假定種群處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下，對(duì)所供試的種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳參數(shù)分析，分別計(jì)算了觀測(cè)等位基因數(shù)(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne)、Nei′s(1973)基因多樣性指數(shù)(Nei′s gene diversity,H)、Shannon′s信息指數(shù)(Shannon′s infornation index,I)、多態(tài)性帶百分率（Percentage of polymorphic bands,PPB），群體總基因多樣性(Total gene diversity,Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Gene diversity within populations,Hs)、群體間的遺傳分化系數(shù)(Coefficient of gene differentiation,Gst)、基因流（Gene flow,Nm）、Nei′s(1978)遺傳距離(Genetic distance，D)和遺傳一致度(Genetic identity，I)。

表2　RAPD所用的引物Table 2 The used RAPD primers with their sequences

2　結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的提取與檢測(cè)

用改良CTAB法提取121份女貞種質(zhì)材料的基因組DNA，經(jīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其OD值。結(jié)果顯示，OD260/OD280均在1.8左右，表明干擾RAPD分析的多糖類和三萜類化合物等雜質(zhì)含量低，所提取的基因組DNA純度較高。經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并與Lambda DNA/HindⅢ+EcoRⅠMarkers比較，片段無彌散現(xiàn)象（見圖1）。

圖1　部分女貞種質(zhì)材料的總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖M為L(zhǎng)ambda DNA/HindШ+EcoRMarkersFig.1Agarose gelelectrophoresis of total DNAof the different germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait

2.2RAPD擴(kuò)增結(jié)果

用上述的所選的10個(gè)引物對(duì)121份女貞種質(zhì)材料進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，可獲得帶型清可辨的DNA指紋圖譜，其擴(kuò)增結(jié)果見表3。在這121份種質(zhì)材料中，10個(gè)引物共擴(kuò)增出94條清晰可重復(fù)DNA譜帶，其中80條為多態(tài)性條帶，占總擴(kuò)增條帶數(shù)的85.11%(見表3)。平均每個(gè)引物擴(kuò)增的帶數(shù)為9.4條，大多數(shù)擴(kuò)增條帶的分子量在200 bp～2100 bp之間。

表3　引物序列及其多態(tài)性Table 3 The sequences of primers used and their polymorphism

2.3女貞不同地理來源材料間的遺傳多樣性分析

根據(jù)供試種質(zhì)材料的起源地域，女貞種質(zhì)材料可分為貴州湄潭、貴州臺(tái)江縣、湖南祁東步云橋鎮(zhèn)、湖南祁東白鶴鎮(zhèn)排山村、湖南祁東白鶴鎮(zhèn)高原村、四川巴中市以及南京農(nóng)大校園7個(gè)居群?；赗APD數(shù)據(jù)，利用PopGene軟件分析女貞7個(gè)居群的遺傳多樣性，其結(jié)果如表4所示。

遺傳多樣性分析結(jié)果表明，在物種水平上，女貞的遺傳多樣性水平較高，平均每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)位點(diǎn)百分率PPB=85.11%，有效等位基因數(shù)Ne=1.4344，Nei’s基因多樣性H=0.2591，Shannon信息指數(shù)I=0.3959；但在居群水平上，女貞的遺傳多樣性水平較低，PPB=37.08%，Ne=1.2590，H=0.1455，I=0.2127。

Shannon信息多樣性指數(shù)顯示了各居群的遺傳變異由高到低依次為南京農(nóng)大校園居群＞湖南祁東步云橋鎮(zhèn)居群＞湖南祁東白鶴鎮(zhèn)高原村居群＞四川巴中市居群＞湖南祁東白鶴鎮(zhèn)高原村居群＞貴州湄潭居群＞貴州臺(tái)江縣居群(見表2)。各居群間均遺傳多樣性差異較顯著，其中南京農(nóng)大校園居群的遺傳多樣性水平最高(PPB=55.32%,H=0.2069,Ne=1.3613，I=0.3046）。

表4　女貞居群的遺傳多樣性Table 4Genetic diversity of germplasm materials ofLigustrum lucidum Ait

2.4女貞居群間的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異分析

基于RAPD分析數(shù)據(jù)，計(jì)算供試女貞種質(zhì)材料總的遺傳多樣性(Ht)和居群內(nèi)遺傳多樣性(Hs)，在此基礎(chǔ)上計(jì)算不同居群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)(見表5)。女貞不同居群總的基因多樣度Ht為0.2453，其中居群內(nèi)的基因多樣性Hs為0.1455；基因流(Nm)為0.7294＜1，表明女貞居群間基因交流有限。女貞居群間遺傳分化指數(shù)Gst=0.4067，表明總的遺傳變異中有40.67%的變異存在居群間，有59.33%的遺傳變異存在于居群內(nèi)。

表5　女貞居群基因多樣性Nei’s分析Table 5 Nei’s(1987)genetic structure analysis amongLigustrum lucidum Ait

2.5女貞種質(zhì)材料的聚類分析

根據(jù)對(duì)RAPD擴(kuò)增條帶分析的結(jié)果，采用UPGMA法對(duì)121份女貞不同居群種質(zhì)材料進(jìn)行分析，建立聚類分析圖(如圖3所示)。聚類分析結(jié)果表明，所有供試材料可顯著地聚為四類群。第一類群中來自貴州省湄潭縣和臺(tái)江縣的材料首先分別按地理來源的不同聚為兩小類，然后再聚為貴州類群；來自湖南祁東縣三個(gè)居群的種質(zhì)材料聚為湖南類群，此類群中不同居群的材料間存在交叉聚類現(xiàn)象，表明湖南祁東縣三個(gè)居群間有明顯的基因交流；此外，來自四川巴中市的材料和南京農(nóng)大的材料也分別聚為四川巴中類群和南京農(nóng)大類群。可見，不同居群的差異以及起源地域差異都可以從聚類分析圖中清晰地反映出來。

3　討論與結(jié)論

3.1RAPD分子標(biāo)記的可靠性

RAPD分子標(biāo)記技術(shù)存在的最大問題是重復(fù)性不太高。但諸多實(shí)例證實(shí)，在應(yīng)用過程中只要認(rèn)真優(yōu)化最佳的反應(yīng)體系和程序設(shè)計(jì)，并保持同一反應(yīng)體系和同一擴(kuò)增程序，完全可以得到重復(fù)性好的結(jié)果，是一種較為有效的分子標(biāo)記方法[19]。本研究的結(jié)果也表明，在嚴(yán)格按照本實(shí)驗(yàn)前期建立的最佳反應(yīng)條件及程度進(jìn)行反應(yīng)所擴(kuò)增出的DNA多態(tài)性良好、條帶清晰，且重復(fù)性好。在進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，雖然多態(tài)性位點(diǎn)越多，所得到的結(jié)果從理論上來說越可靠，但需要付出的人力物力也相應(yīng)增加。此外，當(dāng)多態(tài)性位點(diǎn)增加到一定程度，增加的位點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)確性的貢獻(xiàn)已有限。Pejic等[20]、周澤揚(yáng)等[21]、洪棋斌等[22]的研究結(jié)果基本相近，他們均認(rèn)為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)達(dá)到或超過70個(gè)時(shí)，可得到較為可靠的信息。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用10條有效引物對(duì)121份供試材料進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共獲得多態(tài)性DNA譜帶有96條，以此為基礎(chǔ)的分析結(jié)果已趨于穩(wěn)定。此外，本文所獲得的聚類結(jié)果與可以把不同的材料完全分開，也與材料的地理起源基本一致。因此，作者認(rèn)為引物數(shù)為10時(shí)，分析的結(jié)果不再變化，本研究所得到的結(jié)果真實(shí)可靠地反映了供試女貞的遺傳多樣性。

圖3　121份女貞種質(zhì)材料的聚類分析圖Fig.3 The RAPD cluster analysis dendrogram for 121 germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait

3.2女貞的遺傳多樣性與遺傳分化

Hamrick等[23]曾總結(jié)了662種植物的遺傳多樣性和遺傳分化所得出的平均值為：PPB=51.3%，Na=1.97，H=0.150，Gst=0.228；而其中分布區(qū)較為廣泛的物種的遺傳多樣性和遺傳分化所得出的平均值為：PPB=67.8%，Na=2.11，H=0.257，Gst=0.033；女貞物種水平的遺傳多樣性水平參數(shù)分別為PPB=85.11%，Na=1.8511，H=0.2591，Gst=0.4067。與Hamrick等所得出的平均值相比，女貞的多態(tài)位點(diǎn)百分率，Nei’s基因多樣性指數(shù)及遺傳分化參數(shù)均明顯偏高，說明女貞具有較高的遺傳多樣性。女貞類群間遺傳分化指數(shù)Gst=0.4067，表明總的遺傳變異中有40.67%的變異存在類群間，有59.33%的遺傳變異存在于類群內(nèi)，類群內(nèi)的遺傳分化大于類群間的分化。影響植物類群間遺傳分化的因素很多，基因流一向被視為是使類群遺傳結(jié)構(gòu)均質(zhì)化的主要因素之一，具有有限基因流的物種往往較那些具有廣泛基因流的物種有較大的遺傳分化[24]。女貞的基因流僅為0.7294＜1，表明女貞居群間基因交流有限。因此，有限的基因流可能是引起女貞類群間分化的主要原因之一。

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Application of RAPD Technology to Analysis on the Genetic Diversity and Structure of Ligustrum lucidum Ait

ZHAO Feng1,LIU Guo-min2,LI Juan-ling2*,ZHANG En-hua2,ZHANG Qi-wen2,FU Wei2
1.Hainan Radio and TV university,Haikou 570105,China
2.Kudingcha Research Institute,Hainan University,Haikou 570228,China

The genetic diversity of the 121 germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait from 7 wild populations in China was detected by RAPD molecular markers in the study.10 primers were used to amplify samples of L.lucidum Ait.And 94 DNAbands were got,80 of which was polymorphic,with the percentage of polymorphic bands(PPB)of 85.11%.On average, 9.4 DNA bands were amplified by each primer.The results showed that there was rich genetic diversity in the species level, with Ne=1.4344,H=0.2591,I=0.3959;but lower at the population level(PPB=37.08%,Ne=1.2590,H=0.1455,I= 0.2127).The genetic variation in L.lucidum Ait populations was higher than that among populations.The coefficient of gene differentiation(Gst)was 0.4067,which showed that there was 40.67%of genetic variance among the populations,and 59.33%in the populations.there were limited gene interflows among the populations of L.lucidum Ait.The gene flow(Nm) was 0.7249＜1.

Ligustrum lucidumAit;germplasm resources;genetic diversity;RAPD

S571.1文獻(xiàn)標(biāo)示碼:A

1000-2324(2015)02-0161-07

2014-10-27

2014-11-10

海南省教育廳基金資助項(xiàng)目(Hjkj2012-51);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(39860048)

趙峰(1981-),女,山東章丘人,講師,農(nóng)學(xué)碩士,主要從事植物資源和飼料學(xué)研究.Email:928662418@qq.com

Author for correspondence.Email:ljl0728@126.com