唐乾 史珊珊 曹洪玉 郭相金 張濤 鄭學仿＊,

(1大連大學生命科學與技術學院,大連116622)

(2遼寧省生物有機化學重點實驗室,大連大學,大連116622)

細胞色素C與NO的反應機制

唐乾1,2史珊珊1,2曹洪玉1,2郭相金2張濤1鄭學仿＊,1,2

(1大連大學生命科學與技術學院,大連116622)

(2遼寧省生物有機化學重點實驗室,大連大學,大連116622)

細胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)與NO(由NO供體藥物proliNONOate提供)之間的反應已在電化學和醫(yī)療方面受到重視，而直接與NO氣體作用尚未得到關注；且前者主要是從Q帶進行分析的，Soret帶未提及。本文采用紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜、電子順磁共振(EPR)光譜、紫外可見時間過程光譜以及同步熒光光譜等方法同時分析了其Soret帶與Q帶的變化，探討了不同價態(tài)的Cyt C與NO氣體結合及解離反應的過程。結果表明：Cyt C與NO相互作用時，無論是高鐵細胞色素C(ferric cytochrome C，F(xiàn)e（Ⅱ）-Cyt C)還是亞鐵細胞色素C(ferrous cytochrome C，F(xiàn)e（Ⅱ）-Cyt C)，反應產(chǎn)物都是細胞色素C配合物(Cyt C-NO)；Fe（Ⅱ）-Cyt C先被NO氧化生成Fe（Ⅱ）-Cyt C，之后再與NO結合生成Cyt C-NO，F(xiàn)e（Ⅱ）-Cyt C則直接與NO結合生成Cyt C-NO。Cyt C-NO是一種不穩(wěn)定的配合物，當通入少量NO時Cyt C-NO很快解離生成Fe（Ⅱ）-Cyt C，其解離速率為(0.005 07±0.001)s-1，是與供體藥物結合所形成配合物解離速率的十分之一；NO過量時，生成的Cyt C-NO不會再發(fā)生解離。對實驗結果分析，得出Cyt C與NO配位反應機制為溶液中的NO進入Heme腔內，F(xiàn)e-S斷裂，F(xiàn)e-N間形成新的配位鍵，NO氣體可以直接與Cyt C反應，生成的配合物比供體藥物穩(wěn)定，同時Soret帶具有明顯變化。這對于利用NO來緩解細胞內的氧化壓以及利用NO檢測細胞內呼吸類酶的變化，進而檢測細胞凋亡具有重要意義。

細胞色素C；NO氣體；光譜法；配位反應；解離

0引言

血紅素蛋白與生物活性小分子的配位反應廣泛存在于生命體中，例如二價血紅素鐵蛋白可逆結合氧氣來完成儲存和運輸氧氣[1-3]功能，二價和三價血紅素蛋白均可與信使分子NO配位[4-5]完成各種生理功能，因此，血紅素蛋白與生物活性小分子的配位反應研究備受關注。細胞色素C(Cyt C)是C型血紅素蛋白，在呼吸鏈中將電子由復合物Ⅲ(細胞色素bc1復合物)傳遞到復合物Ⅳ(細胞色素C氧化酶)[6]，使氧氣還原為水[7]。最近發(fā)現(xiàn)Cyt C與細胞程序性死亡[8]、細胞氧化壓力、亞硝基硫醇的形成[9]、過氧硝酸鹽作用的靶向物質、脂肪酸酰胺的生物合成等有關。另外Cyt C還具有亞硝酸還原酶活性，在低氧和硝酸壓力下生成五配位Cyt C，使其具有明顯的亞硝酸還原酶活性，可以將亞硝酸鹽還原生成NO，后者作為細胞凋亡的信號分子[10]。

NO分子一直受到高度關注，是許多生物系統(tǒng)中關鍵性細胞信號分子，控制和調節(jié)各種不同生理過程，包括控制血壓，松弛肌肉，血小板聚集，神經(jīng)遞質傳遞，免疫反應等[11]。NO作為一個活性配體，既可以與高鐵血紅素結合也可以與亞鐵血紅素結合，氧合血紅蛋白與NO結合可以形成亞硝基硫醇化合物，氧合亞鐵肌紅蛋白與NO反應生成氧合高鐵肌紅蛋白與硝酸鹽[12-14]。Kruqlik等[15]利用皮秒時間分辨拉曼光譜和飛秒吸收光譜研究了NO與肌紅蛋白反應對血紅素輔基結構的影響，發(fā)現(xiàn)NO與肌紅蛋白的結合會抑制其血紅素輔基結構的變化，而當NO光解后其血紅素輔基又會由平坦結構恢復至圓頂形結構。

Sharper等[16]已報道Cyt C與NO之間的相互作用情況，研究了在生理條件下NO在線粒體內的代謝機制，線粒體內過多的NO可以與膜蛋白反應，從而抑制其與細胞色素C氧化酶結合，破壞呼吸作用，生成的NO-與氧氣結合會生成過氧硝酸鹽；2011年，Silkstone等[17]發(fā)現(xiàn)NO與Cyt C反應時NO先與O2反應生成NO2+，然后Fe（Ⅱ）-Cyt C再與之反應生成Fe（Ⅱ）-Cyt C和NO2-，最后生成Cyt C-NO。而當NO加入野生型高鐵細胞色素C(Fe（Ⅱ）-Cyt C)中時，也可以快速的形成Cyt C-NO配合物[18]，心磷脂可以使Cyt C中的血紅素鐵由六配位變成五配位，形成與高鐵肌紅蛋白類似的結構[19-21]，五配位的Cyt C可以與NO反應，其反應機制與高鐵肌紅蛋白相似。

以上研究均是用NO供體藥物(proliNONOate)代替NO進行實驗,而直接與NO氣體的反應尚未受到關注。而且其研究主要集中在Q帶，關于Soret帶的變化未提及，根據(jù)Gouterman的四軌道模型，Cyt C分子Soret帶是由卟啉中的電子躍遷產(chǎn)生的，其歸屬與π-π*躍遷的第二激發(fā)態(tài)，對于檢測血紅素卟啉的變化具有重要意義。本文通過UV-Vis吸收光譜、電子順磁共振光譜、紫外可見時間過程光譜、同步熒光光譜等技術同時從Soret帶及Q帶研究了不同價態(tài)的Cyt C與NO的結合與解離反應，發(fā)現(xiàn)六配位的Cyt C可直接與NO氣體反應，其反應產(chǎn)物為Cyt C-NO。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)我們從分子水平上分析了Cyt C與NO的配位反應機理。

1實驗部分

1.1 試劑與儀器

馬心細胞色素C(Cyt C)樣品(美國Sigma公司，〉99%)，使用時用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(PB緩沖液)配制成濃度為1×10-5mol·L-1的溶液(避光4℃保存并盡快用于實驗)；連二亞硫酸鈉(0.5 mol·L-1)；過氧化氫(0.01 mol·L-1,H2O2)；亞硝酸鈉(5 mol·L-1，上海生物工程公司)；濃硝酸(HNO3)(稀釋為0.01、0.025、0.05、0.1、0.16、0.2、0.5、1.15 mol·L-1)；均為國產(chǎn)分析純；實驗用水均為超純水。NO氣體(大連光輝氣體有限公司，高純一氧化氮，〉99%)。V-560型UV-Vis分光光度計(日本Jasco公司)、FP-6500型熒光分光光度計(日本Jasco公司)、電子順磁共振波譜儀(德國Bruker公司)、F-12型制冷和加熱循環(huán)器(德國Julabo公司)、實驗室pH計(PHSJ-4A，上海雷磁分析儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Fe（Ⅱ）-Cyt C與Fe（Ⅱ）-Cyt C的制備

野生型細胞色素C(Cyt C)用0.05 mol·L-1PB緩沖液配制成1×10-5mol·L-1的樣品溶液，取2 mL Cyt C溶液于比色皿內，用微量注射器逐次加入定量的0.5 mol·L-1的連二亞硫酸鈉溶液(制備亞鐵細胞色素C，實驗過程通N230 min，將其O2排出)，過量的連二亞硫酸鈉對亞硝酸鹽沒有影響[22]，同時檢測其紫外吸收光譜(415、520及549 nm處的吸收強度)[23]。測定條件：狹縫寬度為2 nm，掃描波長為220～700 nm，掃描速率為400 nm·min-1，響應時間中等。同樣的方法用H2O2制備高鐵細胞色素C(檢測其在409、530 nm處的紫外吸收光譜)[23]。

1.2.2 樣品前期處理

將Cyt C溶解在磷酸鹽緩沖液中，蛋白的最終濃度達到1×10-5mol·L-1；取樣品分別通入NO，通氣速率為每分鐘100個氣泡，時間為2 min；Fe（Ⅱ）-Cyt C與Fe（Ⅱ）-Cyt C處理同上，所得樣品用于UV-Vis吸收光譜、時間過程光譜和同步熒光光譜測定。

將Cyt C溶解在磷酸鹽緩沖液中，終濃度為1× 10-4mol·L-1；分別制備沒有通入NO氣體、通入NO氣體1 min、通入NO氣體2 min、以及通入NO氣體2 min后放置30 min的樣品各200 μL放置在液氮中，所得樣品用于電子順磁共振譜測定。

1.2.3 UV-Vis吸收光譜

將已處理的Cyt C(WT)、Fe（Ⅱ）-Cyt C和Fe（Ⅱ）-Cyt C樣品置于1 cm石英比色皿中進行測定，測定條件為：狹縫寬度為2 nm，掃描波長范圍220～700 nm，掃描速率400 nm·min-1，響應時間中等。

1.2.4 紫外可見時間過程光譜

將已處理的Cyt C(WT)、Fe（Ⅱ）-Cyt C和Fe（Ⅱ）-Cyt C樣品置于1 cm石英比色皿中進行測定，測定條件為：狹縫寬度為2 nm，固定波長為416、562 nm，靈敏度高，響應時間為2 s。

1.2.5 同步熒光光譜

將已處理的Cyt C(WT)、Fe（Ⅱ）-Cyt C和Fe（Ⅱ）-Cyt C樣品置于1 cm石英比色皿中進行測定，測定條件為：激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫分別為3和5 nm，掃描速率為500 nm·min-1，響應時間為0.5 s，檢測器靈敏度為中等，控制溫度為(20±0.01)℃。

1.2.6 電子順磁共振譜

將液氮中的樣品管垂直放入凹槽內使其底部與里面的基架接觸再進行檢測，測定條件為：9.33 GHz，6-G，10.2 mW，時間常量40.96 ms，掃描速度83.97 s，掃描范圍2 900～3 900 G，溫度100 K，掃描次數(shù)20次。

2結果與討論

2.1 Fe（Ⅱ）-Cyt C與NO的反應過程

Fe（Ⅱ）-Cyt C在415 nm(Soret帶)、520、549 nm(Q帶)和314 nm(δ帶)處有最大吸收峰[22]，而光譜檢測得到Cyt C在360 nm(δ帶)、409.5 nm(Soret帶)、522.5、527.5和549 nm(Q帶)處均有吸收峰，說明Cyt C同時存在氧化態(tài)與還原態(tài)，實驗所用Fe（Ⅱ）-Cyt C(全部排出O2)由連二亞硫酸鈉還原得到。向Fe（Ⅱ）-Cyt C溶液中通入不同量的NO氣體，隨著氣體量增加，F(xiàn)e（Ⅱ）-Cyt C樣品的UV-Vis吸收光譜變化如圖1所示。由圖1可知，在415 nm處Soret吸收帶先藍移到409 nm，隨著NO繼續(xù)增加又紅移到416 nm；520 nm處Q帶紅移到530 nm，同時549 nm處特征吸收峰消失，在562 nm出現(xiàn)新的特征吸收峰，其Q帶的變化與Sharpe等[16]報道的Fe（Ⅱ）-Cyt C與NO結合的吸收光譜相同，同時soret帶也出現(xiàn)了其特征吸收峰。NO進入溶液中暫以NO分子形式存在，具有較強的氧化性，而Fe（Ⅱ）-Cyt C本身具有還原性，直接被氧化生成Fe（Ⅱ）-Cyt C，使得415 nm處Soret吸收帶藍移到409、520 nm處Q帶紅移到530、549 nm處特征峰消失，同時產(chǎn)生NO-，此時停止通NO，放置一段時間后其光譜沒有變化，繼續(xù)通NO，NO進入溶液中以NO·存在，具有較強的親電作用，改變了血紅素周圍微環(huán)境，使得Fe-S變弱，NO進攻Fe-S，N取代S與Fe配位，生成Cyt C-NO，因此Soret的峰紅移到416 nm、Q帶在562 nm處出現(xiàn)新的特征吸收峰。在整個反應過程中，F(xiàn)e(II)-Cyt C直接生成Fe（Ⅱ）-Cyt C，其不能與NO反應生成配合物，與Fe（Ⅱ）-Cyt C反應的NO為通入的過量的NO，因此只有Fe（Ⅱ）-Cyt C可以與NO進行配位反應。

圖1 Fe（Ⅱ）-Cyt C與NO反應的紫外吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorbance spectra of the reaction of Fe（Ⅱ）-Cyt C with NO

2.2 Fe（Ⅱ）-Cyt C與NO的反應過程

Fe（Ⅱ）-Cyt C溶液在409 nm(Soret帶)、529 nm(Q帶)和360 nm(δ帶)處有特征吸收峰[22]，實驗所用Fe（Ⅱ）-Cyt C是由H2O2氧化得到。由圖2可知，F(xiàn)e（Ⅱ）-Cyt C與NO反應的最終現(xiàn)象與Fe（Ⅱ）-Cyt C相同，Soret帶峰紅移到416 nm、Q帶在562 nm處出現(xiàn)新的特征吸收峰，生成的都是Cyt C-NO。上述結果表明，NO主要是與Fe（Ⅱ）-Cyt C結合，F(xiàn)e（Ⅱ）-Cyt C中血紅素鐵是六配位結構，其第6個是與甲硫氨酸(Met)的硫形成配位鍵，NO進入溶液中以NO·存在，具有較強的親電作用，改變了血紅素周圍微環(huán)境，使得Fe-S變弱，NO進攻Fe-S，N取代S與Fe配位，生成Cyt C-NO，但該類化合物并不穩(wěn)定[24]，其受到NO濃度的調節(jié)，在695 nm處小的吸收峰是Met80與血紅素Heme中心三價鐵的電荷轉移峰，即Met80與血紅素Heme配位的特征峰[25-26]，圖3為Cyt C通NO前后Met80與血紅素Heme配位的特征吸收峰，由圖3可知，在沒有通氣前Cyt C在695 nm處有明顯的特征吸收峰，通入NO后695 nm處吸收峰消失。由此可知，NO進入Cyt C溶液后，Met80與血紅素Heme中心鐵不再配位，鐵周圍電子分布發(fā)生變化，溶液中NO易進入Heme腔內，與Fe形成新的配位鍵如圖示1所示。在整個反應過程中生成的Cyt C-NO中Cyt C均是以Fe（Ⅱ）-Cyt C存在。

圖2 Fe（Ⅱ）-Cyt C與NO反應的紫外吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorbance spectra of the reaction of Fe（Ⅱ）-Cyt C with NO

圖3 Cyt C中Fe-S鍵的紫外吸收光譜變化Fig.3 UV-Vis absorbance spectra changes of Fe-S in Cyt C

圖式1細胞色素C中Fe-S的變化過程Scheme 1Course of the changes about Fe-S in Cyt c

2.3 Cyt C與NO相互作用的電子順磁共振譜

EPR是由不配對電子的磁矩發(fā)源的一種磁共振技術，可用于從定性和定量方面檢測物質原子或分子中所含的不配對電子，并探索其周圍環(huán)境的結構特性[27]。Cyt C與NO相互作用的電子順磁共振譜如圖4所示，圖4A為Cyt C中沒有通入NO時的EPR譜，其沒有順磁信號產(chǎn)生，圖4B/C是通入NO的量逐漸增多的EPR譜，其中圖B通氣1 min，圖C通氣2 min，在3 210、3 355和3 385G有明顯的順磁信號產(chǎn)生，說明Cyt C中的血紅素Fe在與NO進行配位反應過程中生成了新的配合物，圖4D為圖4C放置長時間(30 min)后測得的EPR譜，其產(chǎn)生的順磁信號消失。這與Basu等[10]所得的結果相同,Cyt C中通入NO氣體后與之反應生成新的配合物，然而Basu[10]、Kapralov等[28]認為只有加入脂質體或心磷脂等能夠使其由六配位變成五配位結構的物質后Cyt C才可以與NO反應，本實驗證明在沒有加入其它物質的情況下，Cyt C可以直接與NO進行配位反應，生成一種不穩(wěn)定的配合物Cyt C-NO，其會發(fā)生解離，這與紫外、熒光中通少量NO氣體所得實驗結論是一致的。

圖4 Cyt C與不同量NO相互作用及解離的電子順磁共振光譜Fig.4 Electron Paramagnetic Resonance(EPR)Spectra of Cyt c reacting with different amounts of NO and their dissociation process

2.4 硝酸(HNO3)及亞硝酸鈉(NaNO2)對Cyt C的影響

NO通入Cyt C溶液時，會有部分被氧化生成NO2-，進入溶液后，NO2-繼續(xù)被氧化生成NO3-[29]，在沒有進行排氧的Cyt C溶液中NO會被氧化，溶液中存在NO3-、NO2-、H+離子均有可能與Cyt C進行反應，為排除這些離子的影響，本文進行了不同濃度的HNO3以及不同pH的NaNO2與Cyt C反應的實驗。

圖5中，隨HNO3濃度的增加，Cyt c在409 nm處Soret帶吸收波長逐漸藍移且吸收強度增大，530 nm處Q帶吸收峰變化不明顯，549 nm處特征峰逐漸消失，但隨著HNO3濃度的繼續(xù)增加，其Q帶的所有特征吸收峰消失，且吸收強度下降，同時在300 nm處出現(xiàn)了NO3-的特征吸收峰[30]，由以上結果可知，低濃度HNO3可以將還原態(tài)的Cyt C氧化，高濃度的HNO3會破壞Cyt C的結構，而不會與之發(fā)生配位反應，HNO3本身既是一種強酸又是強氧化劑，因此一開始當HNO3濃度很低時對Cyt C的影響較小，只是將其中還原態(tài)Cyt C氧化，隨著HNO3濃度的增加，Cyt C結構逐漸被破壞，血紅素中卟啉環(huán)暴露，因此Soret帶的吸收波長發(fā)生藍移，同時強度增大，Q帶特征吸收峰消失。

圖5 Cyt C與不同濃度的HNO3相互作用的紫外吸收光譜Fig.5 UV-Vis absorbance spectra of Cyt C interacted with different concentrations of HNO3

Cyt C與NaNO2相互作用的光譜如圖6所示，隨NaNO2量的增加，Soret帶的特征吸收峰基本沒有變化，Q帶530 nm處的吸收強度有微弱變化，而549 nm處特征峰消失，所以NaNO2只是將Cyt C溶液中還原態(tài)Cyt C氧化，而沒有與之發(fā)生配位反應，已有文獻報道，Cyt C本身具有亞硝酸還原酶活性[10]，因此NaNO2與Cyt C之間只是發(fā)生了氧化還原反應，并沒有發(fā)生配位反應。實驗中所用的NaNO2的濃度為0.03～0.17 mol·L-1，此處只列出pH=7.4的光譜圖，pH=3、5.8的結果與之相同未列出。因此和不會影響Cyt C與NO的反應。

圖6 Cyt C中加入不同量NaNO2后的紫外吸收光譜變化Fig.6 UV-Vis absorbance spectra changes of Cyt C with different amount of NaNO2

2.5 細胞色素C-NO配合物(Cyt C-NO)的解離

通入一定量NO氣體后，F(xiàn)e（Ⅱ）-Cyt C和Fe（Ⅱ）-Cyt C均會生成Cyt C-NO，在416 nm(Soret帶)、530 nm、562 nm(Q帶)出現(xiàn)特征吸收峰，由于生成的配合物并不穩(wěn)定，隨時間延長逐漸發(fā)生解離，由圖7A可知隨時間變化Cyt C-NO逐漸解離為Fe（Ⅱ）-Cyt C。Orii等[31]已經(jīng)證明當pH值在8～10之間時，F(xiàn)e（Ⅱ）-Cyt C與NO反應生成Fe（Ⅱ）-Cyt C-NO后先被還原為Fe（Ⅱ）-Cyt C-NO和NO+，最終解離為Fe（Ⅱ）-Cyt C與NO+。圖7A為通NO 1.5 min，在10 min內的解離光譜，隨時間增加Q帶562 nm處的吸收峰逐漸消失，529 nm峰位置紅移到530 nm，Soret帶由413 nm下降并藍移到409 nm。圖7B為通氣2.5 min，4 h及20 h后的解離光譜，隨時間變化光譜基本沒有發(fā)生變化。Cyt C與NO反應主要是在Fe（Ⅱ）-Cyt C下進行，與NO結合后生成Cyt C-NO，不穩(wěn)定而自身發(fā)生解離，生成Fe（Ⅱ）-Cyt C，可以調節(jié)生物體內NO的量，而當通NO過量時，溶液中的NO·過量，生成大量的NO-，破壞該反應的平衡，使得反應生成的Fe（Ⅱ）-Cyt C-NO不變，因此當通入過量NO時，Cyt CNO未發(fā)生解離。圖8 A1、A2為通NO 2 min后Cyt C-NO在Soret帶416 nm以及Q帶562 nm處時間變化的光譜圖，圖8B1、B2為通NO 2.5 min后Cyt C-NO在Soret帶416 nm以及Q帶562 nm處的時間變化的光譜圖。由圖可知當通入的NO氣體較少時，Cyt C與NO之間的反應是一個可逆的過程，Cyt C與NO的反應產(chǎn)物隨時間逐漸解離，一定時間以后達到穩(wěn)定(500～1 000 s內)，說明反應所生成的Cyt C-NO是一種不穩(wěn)定的配合物，NO過量時，Cyt CNO不再發(fā)生解離。因此適當濃度的NO對調節(jié)Cyt C的生理作用非常重要。

對Cyt C-NO的時間解離曲線進行擬合發(fā)現(xiàn)該曲線符合方程(1)，結果如表1所示：

圖7 通不同量NO的CytC-NO隨時間的解離光譜Fig.7 Dissociation spectra of CytC-NO with different amounts of NO by time

圖8 通不同量NO的Cyt C-NO的時間過程光譜Fig.8 Time course spectra of Cyt C-NO with different amounts of NO

表1 Cyt C-NO的解離速率常數(shù)及相關參數(shù)Table1 Dissociation rate constants and the related parameters of Cyt C-NO

其中y為固定波長下的紫外吸收強度，t為反應時間，A為振幅，k為解離速率常數(shù)，y0為截距。因此隨時間變化Cyt C-NO的解離過程屬于一級反應，Soret帶的k值為0.005 07 s-1，Q帶的k值為0.003 97 s-1，兩譜峰所計算的k值接近，其相關系數(shù)R分別為0.978 26、0.990 2，均接近1，排除實驗中一些外界因素的影響，結果在誤差允許范圍內，說明Cyt C-NO的解離曲線符合上述方程。而其解離速率較供體藥物（(0.087±0.054)s-1）慢，僅是其十分之一，說明NO氣體與Cyt C形成的配合物更穩(wěn)定。而改變外界條件，如離子強度、溫度、pH值、緩沖溶液、粘性劑以及光照等，均會影響Cyt C與NO的結合及解離速率。隨離子強度增大，其反應速率下降；溫度、pH變化會影響Cyt C的二級結構[32]，從而影響NO與Cyt C的結合速率；而光照會促進Cyt C-NO解離等,其具體影響機制,在今后的文章中會有詳細闡述。

2.6 Cyt C與NO反應的同步熒光光譜

Cyt C分子含有1個色氨酸殘基和4個酪氨酸殘基，選擇合適的Δλ可得到酪氨酸和色氨酸殘基的特征性同步熒光光譜[33]，Δλ=20 nm時，Cyt C的熒光光譜只出現(xiàn)酪氨酸的熒光峰，Δλ=80 nm或60 nm時只出現(xiàn)色氨酸的熒光峰[34]，本實驗通過對比發(fā)現(xiàn)在Δλ=60 nm時得到的熒光圖譜較明顯，因此實驗中色氨酸的同步熒光光譜均是在Δλ=60 nm的條件下得到的。Cyt C酪氨酸與色氨酸的同步熒光光譜如圖9A/B。由圖9A可知，Cyt C在305和460 nm有明顯的熒光峰，305 nm是其酪氨酸的同步熒光峰，而460 nm處是其卟啉環(huán)的同步熒光峰。隨NO通入量的增加，305 nm處的熒光峰強度逐漸下降，460 nm處的強度逐漸上升，同時在394 nm附近出現(xiàn)了一個新的熒光峰。Cyt C中的血紅素卟啉環(huán)上的Fe原子與Met80中的S和His中的N相連接，它的血紅素基團由數(shù)個賴氨酸殘基形成環(huán)狀，這些賴氨酸的ε-氨基帶有正電荷，對其側鏈中的酪氨酸造成熒光猝滅，而且酪氨酸67苯環(huán)上的羥基被認為同Met80的S有氫鍵形成，對維持Met80與Heme的配位起著重要的作用[35]，當NO進入Cyt C溶液后破壞了Heme所在腔的極性環(huán)境，Met80與Heme相連的鐵硫鍵斷裂，使得Heme暴露程度增加，促進酪氨酸的熒光猝滅，因此隨著NO量增加使得酪氨酸在305 nm處的熒光強度逐漸減小，而460 nm處熒光強度逐漸增大，這與前面紫外吸收光譜中Soret帶變化一致，新熒光峰的出現(xiàn)與前面Q帶變化一致。由圖9B可知，Cyt C在344和444 nm處有熒光峰，344 nm是其色氨酸的同步熒光峰，444 nm處是其卟啉環(huán)的同步熒光峰。隨NO的通入，344 nm處發(fā)射波長藍移至337 nm，且強度下降，而444 nm紅移到446 nm強度上升。Cyt C中只含有一個色氨酸殘基，位于第59位，并以氫鍵方式與血紅素相鍵合，因而色氨酸殘基的最大發(fā)射峰的位移直接反映了血紅素對溶劑的暴露程度，當NO通入Cyt C溶液后，與其相互作用，改變了其周圍環(huán)境，Cyt C中血紅素暴露程度增強，色氨酸殘基最大發(fā)射峰發(fā)生藍移，而444 nm處發(fā)射峰也與前文中紫外吸收光譜中的Soret帶變化是一致的。酪氨酸與色氨酸的同步熒光光譜的變化說明Cyt C與NO進行了配位反應。

圖9 Cyt C的同步熒光光譜Fig.9 Synchronous fluorescence spectra of Cyt C

圖示2Cyt C與NO的反應過程Scheme 2Reaction course of Cyt C with NO

3結論

本文采用光譜法研究不同價態(tài)Cyt C與NO氣體之間的相互作用，其可能存在的配位有3種：(1) NO進攻鐵硫鍵，使其斷裂后，與之結合生成Cyt CNO；(2)NO進入溶液后生成硝酸根離子，再與Cyt C結合，生成Cyt C-NO；(3)NO進入溶液后生成亞硝酸根離子(NO2-)，再與Cyt C結合生成Cyt C-NO；最終通過實驗證明只能是第一種途徑，結果同時顯示NO氣體與供藥物的反應過程基本相同：Fe（Ⅱ）-Cyt C與NO反應先生成Fe（Ⅱ）-Cyt C，之后再與NO反應生成Fe（Ⅱ）-Cyt C-NO，F(xiàn)e（Ⅱ）-Cyt C-NO在沒有其他還原劑存在的情況下，會逐步解離為Fe（Ⅱ）-Cyt C。NO氣體可以直接與Cyt C結合，所生成的配合物解離速率僅是供體藥物的十分之一，對于有效的利用NO具有重要的參考意義。NO過量會破壞溶液的平衡使反應向生成Fe（Ⅱ）-Cyt C-NO方向進行，不再發(fā)生解離。Cyt C與NO之間的具體配位反應機制為：NO進入溶液以NO·形式存在，使Cyt C周圍的微環(huán)境發(fā)生變化，進入到Heme腔中改變其電子分布，增大了Met80與Heme之間的距離，使其相互作用減弱，Met與Heme之間的配位鍵改變，分子間發(fā)生重排，其中心Fe與NO形成新配位鍵，但所形成的Fe-N鍵不穩(wěn)定，當NO量較少時，隨時間變化又會斷裂，再次生成五配位Fe，可以與溶液中的自由基團結合，最終達到一個平衡，當不斷通入NO時，所形成的配位鍵不再發(fā)生斷裂，破壞了其達到的平衡。呼吸作用在人類生命活動中必不可少，NO氣體無色無味的，容易被吸入，通過研究該反應機制，為今后研究其它血紅素類蛋白與NO及其它氣體(CO)之間的相互作用提供參考依據(jù)，同時在醫(yī)學上治療NO中毒以及合理利用NO提供支持。

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Reaction Mechanism of Cytochrome C with NO

TANG Qian1,2SHI Shan-Shan1,2CAO Hong-Yu1,2GUO Xiang-Jin2ZHANG Tao1ZHENG Xue-Fang＊,1,2
(1College of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)
(2Liaoning Key Laboratory of Bio-organic Chemistry,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)

The research of cytochrome C(Cyt C)reacting with NO donor drugs(proliNONOate)has been focused on electrochemistry and medical treatment,while the study about reacting with NO gas is ignored.The previous study usually concentrated on Q band changes,but the Soret band was hardly mentioned.In this paper,we studied the reaction of two states of Cyt C with NO gas and the dissociation process by Soret band and Q band spectra,using ultraviolet-visible absorption spectra,electron paramagnetic resonance(EPR)spectra,ultravioletvisible time course absorption spectra and synchronous fluorescence.The spectroscopic data showed that,ferric cytochrome C(Fe（Ⅱ）-Cyt C)and ferrous cytochrome C(Fe（Ⅱ）-Cyt C)could react with NO to convert to cytochrome C coordination compound(Cyt C-NO)with different mechanisms.Fe（Ⅱ）-Cyt C reacting with NO generated Fe（Ⅱ）-Cyt C firstly,then it combined with NO,while Fe（Ⅱ）-Cyt C can combine with NO directly.However,Cyt C-NO is not a stable coordinated macromolecule.With a small amount of NO bubbled into the sample,Cyt C-NO dissociated rapidly with rate constant value of(0.005 07±0.001)s-1,which is one-tenth of Cyt C-NO with NO donor drugs; while under excessive NO gas condition,the dissociation process was prevented.According to the experimentaldata,the coordination mechanism of the reaction between Cyt C and NO is that gas molecule gets access into the cavity of Heme,making the separation of Fe-S and the formation of Fe-N.Cyt C can react with NO gas directly, the Cyt C-NO is more stable than that reacted with NO donor drugs,and the Soret band have an obvious change. These results will be significant for us to remit the oxidative stress in cells and detect the respiratory enzymes change which could monitor the cell apoptosis and some diseases by NO.

cytochrome c;nitric oxide;spectrometry;coordination reaction;dissociation

O629.73；Q518.2

A

1001-4861(2015)08-1511-09

10.11862/CJIC.2015.216

2014-09-05。收修改稿日期：2015-05-07。

國家自然科學基金(No.21271036,20871024)；遼寧省教育廳科學技術研究(No.L2013470,L2013471)資助項目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：dlxfzheng@126.com