賀軍 曹金敏 陳國(guó)棟 賀更生 凌暉

胰腺癌的發(fā)病率與死亡率基本接近，預(yù)后極差。胰腺癌臨床表現(xiàn)不典型，且具有浸潤(rùn)侵襲生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，病程進(jìn)展較快，大多數(shù)患者在診斷后1年內(nèi)死亡，5年生存率<6%[1]。胰腺癌的早期浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及術(shù)后局部或全身極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是胰腺癌致死的主要原因。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、治療、預(yù)后及耐藥等分子機(jī)制研究的深入，從基因水平闡述胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移，并通過(guò)基因治療胰腺癌可能是未來(lái)有效且安全的途徑。

miRNAs是一類(lèi)僅有17～25 nt的小分子單鏈RNA，不編碼蛋白質(zhì)，主要是通過(guò)與mRNA中3'非編碼區(qū)（3＇UTR）配對(duì)抑制或降解mRNA，在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。miRNA不但在增殖凋亡、分泌代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程中發(fā)揮作用，而且在包括腫瘤在內(nèi)的諸多疾病等病理過(guò)程中扮演重要角色。miRNA表達(dá)不但可抑制抑癌基因發(fā)揮致癌基因作用，亦可發(fā)揮抑癌基因起抑癌作用，且不同腫瘤、同一腫瘤不同時(shí)期表達(dá)miRNA種類(lèi)及表達(dá)量均不一樣，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的各個(gè)調(diào)控過(guò)程發(fā)揮重要作用[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNA中miR-103的異常表達(dá)可能參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展[3-6]，但是對(duì)于其侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍未闡明。本研究檢測(cè)不同侵襲性胰腺癌細(xì)胞株表達(dá)miR-103a-3p水平，進(jìn)一步觀察表達(dá)抑制慢病毒載體轉(zhuǎn)染高表達(dá)miR-103a-3p的PANC-1胰腺癌細(xì)胞株后對(duì)其表達(dá)的抑制作用，為闡明胰腺癌的發(fā)病機(jī)制及篩選治療靶基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒 人正常胰腺細(xì)胞系H6C7購(gòu)自中山大學(xué)腫瘤防治研究中心，人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1與BXPC-3購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所，慢病毒包裝細(xì)胞293T細(xì)胞購(gòu)自上海Genechem基因公司。GV-159載體、輔助包裝載體pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體購(gòu)自上海Genechem公司。

1.1.2 試劑和試劑盒 DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone）、KSFM培養(yǎng)基（美國(guó)Life Technologies）、胰蛋白酶（北京Solarbio）、胎牛血清（美國(guó)Gibco）、rEGF、BPF（以色列ProSpec）RNA酶抑制劑（北京Solarbio）、Rnase inhibitor（北京天恩澤公司）、RNA marker（ 美 國(guó) Sigma）、SYBR? PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit（TaKara公司）、慢病毒包裝試劑盒（上海 Genechem）、Lipofectamine 2000（ 美 國(guó) Invitrogen）、質(zhì)粒抽提試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與RNA提取及濃度和完整性檢測(cè)PANC-1、BXPC-3采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，H6C7采用含細(xì)胞因子rEGF、BPF的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。取各對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值分析RNA純度。1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-103a-3p的表達(dá) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用SYBR? PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit檢 測(cè) PANC-1、BXPC-3與 H6C7細(xì)胞的miRNA-103a-3p。引物序列：miR-103a-3p：CCATTGTACAGGGCTATGAAAA；U6（ 內(nèi) 參 ）：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT。37 ℃、60 min下進(jìn)行Poly（A）加尾、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、5 s預(yù)變性；95 ℃變性60 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，待結(jié)束后用PCR儀自帶軟件進(jìn)行分析，獲得產(chǎn)物CT值。各細(xì)胞組中miR-103a-3p相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法為：2-DDCt=癌細(xì)胞的（CtmiR-103a-3p-CtU6）-正常細(xì)胞的（CtmiR-103a-3p-CtU6）。

1.2.3 慢病毒載體的構(gòu)建與包裝 合成hsa-miR-103a-3p-inhibitor引物序列：F：5’-AATTCAAAAAA GCAGCATTGTACAGGGCTATGA-3’，R：5’-CCGGTC ATAGCCCTGTACAATGCTGCTTTTTTG-3’，PCR 擴(kuò) 增后，將產(chǎn)物克隆到慢病毒載體GV159上，構(gòu)建慢病毒載體GV-159。同時(shí)設(shè)未進(jìn)行任何序列加工的空殼病毒載體（吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建的商業(yè)載體）作為慢病毒載體GV-159的陰性對(duì)照。將質(zhì)粒抽提試劑盒提取的慢病毒包裝系統(tǒng)DNA溶液（含GV-159或空殼病毒載體，pHelper 1.0，pHelper 2.0）的稀釋液與Lipofectamine 2000 試劑的稀釋液混勻、溫育，制備DNA/Lipofectamine 2000稀釋液復(fù)合物，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后取含病毒顆粒上清液，離心獲取病毒濃縮液（miR-103a-3p-inhibitor病毒和空殼載體陰性對(duì)照病毒），熒光法測(cè)定病毒滴度。

1.2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選與鑒定 接種高表達(dá)miR-103a-3p的PANC-1細(xì)胞，使其培養(yǎng)過(guò)夜后細(xì)胞融合度大約為50%，去除完全培養(yǎng)基，加入包裝的miR-103a-3p-inhibitor病毒或陰性對(duì)照病毒，使MOI（感染指數(shù)=病毒數(shù)/細(xì)胞數(shù)）=50，培養(yǎng)12 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后用倒置顯微鏡觀察GFP熒光，計(jì)算病毒對(duì)PANC-1細(xì)胞的感染效率。按上述方法進(jìn)行qRT-PCR，鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中miR-103a-3p的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均用（x-±s）表示，使用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各細(xì)胞株總RNA完整性分析 分別取胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、BxPC-3和永生化正常胰腺細(xì)胞H6C7總RNA于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)28S、18S、5S三條帶，且28S的亮度為18S的兩倍，無(wú)其他雜帶（圖1），表明提取的總RNA質(zhì)量好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 RNA完整性檢測(cè)電泳圖

2.2 各細(xì)胞株miR-103a-3p的表達(dá) 以正常胰腺細(xì)胞H6C7作為對(duì)照組，miR-103a-3p在PANC-1、BxPC-3和H6C7細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量分別為（4.949±0.130）、（1.417±0.120）、（1.010±0.151）， 兩 兩 組 間 比 較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），miR-103a-3p在PANC-1表達(dá)量最高（圖2）。

圖2 miR-103a-3p在各細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 miR-103a-3p-inhibitor慢病毒滴度 將收獲慢病毒液進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?0、1、10-1μL）后分別感染293T細(xì)胞，3 d后熒光顯微鏡下1 μL病毒液基本上可將5×106/mL細(xì)胞全部感染（圖3），計(jì)算病毒原液病毒濃度約5×108TU/mL，此濃度可用于下一步慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.4 慢病毒感染PANC-1細(xì)胞株 慢病毒感染PANC-1細(xì)胞第4天，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)miR-103a-3p-inhibitor慢病毒感染組（命名為Control-PANC-1組）和陰性對(duì)照慢病毒感染組（命名為NCPANC-1組）中報(bào)告基因GFP表達(dá)強(qiáng)度高，在細(xì)胞胞漿中聚集成團(tuán)塊狀，在未感染空白對(duì)照組中未見(jiàn)熒光表達(dá)（圖4）。

圖 3 病毒滴度測(cè)定（100倍）

圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染PANC-1熒光細(xì)胞圖（200倍）

2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后qRT-PCR檢測(cè)miR-103a-3p相對(duì)表達(dá)量 以胰腺癌細(xì)胞PANC-1作為對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染PANC-1組相對(duì)表達(dá)量（1.002±0.160）與NC-PANC-1組（0.956±0.250）相比，無(wú)明顯差異（P>0.05），而 Control-PANC-1組（0.317±0.320）分別與NC-PANC-1組相比，其表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。

圖5 miR-103a-3p在未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量

3 討論

miRNA在腫瘤的發(fā)生進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移、診斷預(yù)后、耐藥以及評(píng)估治療反應(yīng)等方面起重要作用。隨著miRNA深入研究，越來(lái)越多的信息提示miRNA為胰腺癌的診斷、治療以及判斷預(yù)后提供一個(gè)新的進(jìn)展方向[7-12]。

miR-103作為miRNA家族中的一員，包括miR-103-1和miR-103-2，位于泛酰酸激酶（PANK）家族中兩個(gè)成員PANK3 和PANK2的內(nèi)含子區(qū)域。鑒于目前的理論基礎(chǔ)以及胰腺癌組織芯片結(jié)果中miR-103異常高表達(dá)，筆者推測(cè)miR-103a-3p在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮一定作用。本研究選擇兩株侵襲能力高低不同的胰腺癌細(xì)胞株（PANC-1>BxPC-3）和一株永生化正常胰腺細(xì)胞（H6C7）作為研究對(duì)象，因這些細(xì)胞株在相關(guān)研究中比較深入且被文獻(xiàn)[13-14]認(rèn)可。

miR-103在卵巢癌、乳腺癌中高表達(dá)，在惡性間皮瘤中低表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及有助于腫瘤的診斷，胰腺癌組織中的miR-103高表達(dá)與其他miRNA聯(lián)合檢測(cè)有助于胰腺癌的診斷[15-17]。本研究應(yīng)用qRTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯要高于正常胰腺細(xì)胞，與相關(guān)研究中胰腺癌組織中高表達(dá)結(jié)果一致，這也初步證實(shí)了miR-103a-3p表達(dá)上調(diào)與胰腺癌的發(fā)生具有一定的關(guān)聯(lián)[10]。miR-103與腫瘤的相關(guān)生物學(xué)進(jìn)展密切相關(guān)，miR-103在子宮內(nèi)膜癌、食管癌、結(jié)腸癌中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可影響患者的預(yù)后[18-20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三株細(xì)胞中miR-103a-3p均有一定量表達(dá)，相對(duì)正常胰腺細(xì)胞H6C7來(lái)說(shuō)，侵襲力較強(qiáng)的PANC-1細(xì)胞中表達(dá)最高，提示miR-103a-3p可能參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。

Moncini等[21]在利用miR-103 的反義寡核苷酸和siRNA載體能降低治療人類(lèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中miR-103的表達(dá)，且能使該腫瘤細(xì)胞侵襲的能力降低很多，從而阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。燕海嬌[22]利用慢病毒介導(dǎo)microRNA-20a過(guò)表達(dá)后能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移。本研究中將抑制miR-103a-3p表達(dá)的特異性載體進(jìn)行慢病毒包裝并感染高表達(dá)miR-103a-3p的PANC-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-103a-3p抑制表達(dá)的慢病毒后的細(xì)胞中miR-103a-3p表達(dá)水平顯著下降，進(jìn)一步提示miR-103a-3p可能參與促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展，并可能作為胰腺癌治療的靶位。

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