崔智慧，崔 巖，孫高潔，王 姣，王守俊

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科鄭州450052

肥胖易引起相關(guān)機體紊亂，如胰島素抵抗、糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓和慢性腎臟病變等，并且增加心血管病的發(fā)病率和病死率［1］。研究［2］稱約90%的2 型糖尿病患者超重或肥胖。機體肥胖狀態(tài)時最主要的病理學(xué)改變是脂肪組織增生肥大和脂肪細(xì)胞功能受損，由此可誘發(fā)脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗。越來越多的研究［3］證實脂肪組織能夠生成和分泌大量的細(xì)胞因子、生長因子和活性肽等。因此，脂肪組織被認(rèn)為是一種十分重要的內(nèi)分泌器官，其所分泌的脂肪因子不僅參與生理狀態(tài)下糖脂代謝、免疫及心血管功能的維持與調(diào)控，而且在肥胖、炎癥、代謝綜合征和心血管疾病等的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色［4］。對脂肪因子瘦素、脂聯(lián)素、CTRP3 和炎癥因子TNF-α、IL-6 的研究，為未來糖尿病及肥胖相關(guān)性疾病的治療提供了新的思路［5］。該研究旨在觀察新型降糖制劑胰高血糖素樣肽-1 類似物利拉魯肽對小鼠脂肪細(xì)胞脂肪因子、炎癥因子的影響，探討利拉魯肽改善胰島素抵抗的分子機制及其對炎癥信號通路影響的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞和試劑 小鼠前脂肪細(xì)胞株3T3-L1 細(xì)胞購自武漢博士德公司。地塞米松(Dex)、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobuthyl-1-methylxanthine，IBMX)購自美國Sigma 公司;Trizol 試劑盒購自Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司;熒光定量PCR 試劑盒購自Roche 公司;IKK-β 抗體、磷酸化IKK-β(ser181)抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG 均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1．2 細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化成熟 將3T3-L1 前脂肪細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖雙抗培養(yǎng)基中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至完全融合，48 h 后換用含1 μmol/L Dex、0．5 μmol/L 胰島素、0．5 mmol/L IBMX的DMEM 高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，3 d 后換用含1 μmol/L Dex、0．5 μmol/L 胰島素的DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換液1次，至第10天，約90%的細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型時行下一步處理。

1．3 實驗分組及處理 將利拉魯肽溶于培養(yǎng)基中，配成終濃度為10－5mol/L 的溶液。0(對照)、1、10和100 nmol/L 利拉魯肽處理細(xì)胞48 h 后收集細(xì)胞備用，100 nmol/L 利拉魯肽分別處理細(xì)胞0、8、24 和48 h 后收集細(xì)胞備用，每組均設(shè)3個復(fù)孔。

1．4 qRT-PCR 檢測各因子的表達水平 根據(jù)GenBank 中的瘦素、脂聯(lián)素、CTRP3、TNF-α、IL-6 和內(nèi)參β-actin 的基因序列設(shè)計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。使用Trizol 法分別提取上述各組脂肪細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后行qRT-PCR 擴增。反應(yīng)體系:上、下游引物(1 μmol/L)各4 μL，SYBR Green 10 μL，Rnase-free 水10 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性10 s，60℃退火/延伸10 s。每次延伸步驟結(jié)束后，通過檢測反應(yīng)體系中SYBR Green 與雙鏈DNA 結(jié)合后所發(fā)出的熒光強度來定量PCR 擴增產(chǎn)物大小。

表1 PCR 引物序列

1．5 IKK-β 及ser181 蛋白表達的檢測 收集0、1、10 和100 nmol/L 利拉魯肽處理48 h 后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，采用Western blot檢測IKK-β 及ser181 蛋白的表達。SDS-PAGE 膠上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗稀釋1 000 倍后使用，搖床4℃孵育過夜，TBST 洗膜5 min ×3次，加HRP 標(biāo)記的稀釋1 000 倍的二抗孵育1 h，DAB 顯色。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進行數(shù)據(jù)分析，不同濃度利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞和100 nmol/L 利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞0、8、24、48 h 對脂肪因子和炎癥因子mRNA 表達的影響，以及不同濃度利拉魯肽對3T3-L1 脂肪細(xì)胞IKK-β 及ser181 蛋白表達的影響采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 法，檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞48 h 后對脂肪因子、炎癥因子mRNA 表達的影響見表2。

表2 不同濃度利拉魯肽對3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂肪因子和炎癥因子mRNA 表達的影響(n=3)

2．2 100 nmol/L 利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞不同時間對脂肪因子及炎癥因子mRNA 表達的影響 見表3。

表3 100 nmol/L 利拉魯肽作用不同時間對3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂肪因子和炎癥因子mRNA 表達的影響(n=3)

2．3 不同濃度利拉魯肽對3T3-L1 脂肪細(xì)胞IKKβ、ser181 蛋白表達的影響 0、1、10 和100 nmol/L利拉魯肽作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞48 h 后對IKK-β蛋白的表達水平無影響，而對IKK-β 蛋白的磷酸化有抑制作用，且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 不同濃度利拉魯肽對3T3-L1脂肪細(xì)胞IKK-β、ser181 蛋白表達的影響

3 討論

2 型糖尿病患者常伴有肥胖、血脂紊亂、非酒精性脂肪肝等代謝相關(guān)性疾病［6］。新型抗糖尿病藥物利拉魯肽不僅具有控制血糖、減輕體重、改善胰島素抵抗和降低心血管疾病發(fā)生風(fēng)險的作用，還具有潛在的抗炎作用，能夠改善肥胖患者的慢性炎癥狀態(tài)。

該研究結(jié)果顯示利拉魯肽能夠降低3T3-L1 脂肪細(xì)胞瘦素、TNF-α、IL-6 mRNA 的表達。瘦素是由肥胖基因所編碼的一種分泌型蛋白質(zhì)，其表達的增加與胰島素抵抗呈正相關(guān)。TNF-α 可對脂肪細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生多種影響，如活化細(xì)胞因子的基因表達、加速胰島素抵抗的發(fā)生等［7］。IL-6 可介導(dǎo)肥胖誘發(fā)的慢性炎癥和胰島素抵抗。利拉魯肽降低3T3-L1 脂肪細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA 表達的結(jié)果表明其在體外有抗炎作用。該研究結(jié)果亦顯示利拉魯肽能夠增加3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素和CTRP3 mRNA 的表達。脂聯(lián)素在體內(nèi)的生理作用主要是增加胰島素的敏感性和促進糖脂代謝［8］，并且通過與其他炎癥因子的相互調(diào)節(jié)控制炎癥反應(yīng)。CTRP3 是近年發(fā)現(xiàn)的新型脂肪因子，與脂聯(lián)素高度同源［9］。相關(guān)研究［10］表明，CTRP3 基因敲除的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)病變更為嚴(yán)重，證實CTRP3 具有抗炎作用。該研究結(jié)果表明利拉魯肽可通過增加抗炎脂肪因子的表達而改善機體的炎癥狀態(tài)。

IKK/Iκ/NF-κ 通路是體內(nèi)主要的炎癥信號通路。IKK-β 可以直接刺激IRS-1 導(dǎo)致絲氨酸抑制性磷酸化，損害胰島素信號傳導(dǎo)［11］，更重要的是IKKβ 激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，后者激活包括TNF-α 和IL-6 在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，進一步抑制胰島素信號傳導(dǎo)［12］。因此，IKK-β 信號通路的激活是導(dǎo)致細(xì)胞炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的重要調(diào)節(jié)因素。該研究中利拉魯肽在一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性地抑制ser181 蛋白表達，而不改變IKK－β 蛋白的表達，推測利拉魯肽可能通過降低IKK－β 的磷酸化水平發(fā)揮改善機體炎癥狀態(tài)的功能。

綜上所述，利拉魯肽不僅能夠減少炎癥因子TNF－α、IL－6 的表達，而且能夠增加抗炎脂肪因子脂聯(lián)素、CTRP3 的表達，而這些作用可能通過抑制IKK－β 的磷酸化實現(xiàn)。

［1］Leal Vde O，Mafra D．Adipokines in obesity［J］．Clin Chim Acta，2013，419:87

［2］Jiao P，Xu H．Adipose inflammation:cause or consequence of obesity－related insulin resistance［J］．Diabetes Metab Syndr Obes，2008，1:25

［3］Waki H，Tontonoz P．Endocrine functions of adipose tissue［J］．Annu Rev Pathol，2007，2:31

［4］Maury E，Brichard SM．Adipokine dysregulation，adipose tissue inflammation and metabolic syndrome［J］．Mol Cell Endocrinol，2010，314(1):1

［5］祝燁，黃德嘉．脂肪因子的研究進展［J］．生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2010，27(2):476

［6］朱雅靜，朱立勤．利拉魯肽對肥胖2 型糖尿病患者代謝及炎癥指標(biāo)的影響［J］．中國慢性病預(yù)防與控制，2014，22(1):88

［7］Ikeoka D，Mader JK，Pieber TR．Adipose tissue，inflammationand cardiovascular disease［J］．Rev Assoc Med Bras，2010，56(1):116

［8］Spranger J，Kroke A，M?hlig M，et al．Adiponectin and protection against type 2 diabetes mellitus［J］．Lancet，2003，361(9353):226

［9］Maeda T，Abe M，Kurisu K，et al．Molecular cloning and characterization of a novel gene，CORS26，encoding a putative secretory protein and its possible involvement in skeletal development［J］．J Biol Chem，2001，276(5):3628

［10］Murayama MA，Kakuta S，Maruhashi T，et al．CTRP3 plays an important role in the development of collagen－induced arthritis in mice［J］．Biochem Biophys Res Commun，2014，443(1):42

［11］Gao Z，Hwang D，Bataille F，et al．Serine phosphorylation of insulin receptor substrate 1 by inhibitor kappa B kinase complex［J］．J Biol Chem，2002，277(50):48115

［12］Shoelson SE，Lee J，Goldfine AB．Inflammation and insulin resistance［J］．J Clin Invest，2006，116:1793