陳春霞，王中陽，顧桂香，楊益眾*，梁國華

(1.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009;2.揚(yáng)州大學(xué)教育部功能基因組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

隨著轉(zhuǎn)基因棉花在我國的大面積種植，棉田化學(xué)農(nóng)藥用量銳減，給棉花種植者和棉田生態(tài)環(huán)境保護(hù)帶來了無法估量的利益。然而，化學(xué)殺蟲劑用量減少后，棉田一些次要害蟲有抬頭趨勢。如棉大卷葉螟，其種群數(shù)量在長江中下游部分棉區(qū)有所回升(王厚振等，2002;劉芳等，2005;黃東林等，2005)，特別是八月中旬以后的第四代、第五代，種群數(shù)量大，卷葉率高，已成為棉花中后期的重要食葉性害蟲(陳建等，2008)。關(guān)于該害蟲的生物學(xué)特性、種群動態(tài)、發(fā)生與不同棉花品種及作物布局間的關(guān)系，前人已做過不少研究(康曉霞等，2006;康曉霞等，2007;陳建等，2008;陸佩玲等，2008;Lu et al.，2011)。然而，在轉(zhuǎn)基因棉花的生長后期如何控制棉大卷葉螟的種群密度、減少其為害，必須根據(jù)轉(zhuǎn)基因棉花的生長特點(diǎn)，從減少化學(xué)農(nóng)藥用量的角度，制定防治該害蟲的新舉措。論文作者根據(jù)家蠶Bombyx mori 后部絲腺中絲素重鏈、輕鏈與P25 三種蛋白的性質(zhì)(汪生鵬等，2009)，利用GenBank已經(jīng)登錄的幾種吐絲昆蟲輕鏈基因的保守區(qū)域，經(jīng)過一年多的研究探索，成功地釣取到了棉大卷葉螟的吐絲基因片段，并進(jìn)行了基因測序?，F(xiàn)將部分結(jié)果報告于下。

1 材料與方法

1.1 蟲源

試驗(yàn)所用棉大卷葉螟蟲源采自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場棉田中，幼蟲飼以苘麻葉片，幼蟲化蛹羽化后每天飼以5%的蜂蜜水，至十月份后，將老熟幼蟲至于室外罩籠內(nèi)，讓其自然越冬，以便隨時取用。

1.2 相關(guān)試劑

1.2.1 PCR 試劑

RNA 提取試劑:Promega 公司的SV Total RNA Isolation System 試劑盒;反轉(zhuǎn)錄試劑:TaKaRa 公司的PrimeScriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit 試劑盒;酶:TaKaRa 公司的TaKaRa Taq DNA 聚合酶和TaKaRa LA Taq;膠回收:TaKaRa 公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0 試劑盒。

1.2.2 克隆試劑

載體:TaKaRa 公司的pMD 18-T Vector;氨芐青霉素:上海潤興生物提供;感受態(tài)細(xì)胞:TaKaRa 公司的E.coli Competent Cells DH5α。

1.2.3 主要試劑的配制

LB 液體培養(yǎng)基:Bacto-tryptone(胰蛋白胨)10.0 g，Bacto-yeast extract(酵母提取物)5.0 g，NaCL 10.0 g，溶解于1 L 超純水中，120℃，高壓滅菌20 min。LB 固體培養(yǎng)基:Bacto-tryptone(胰蛋白胨)10.0 g，Bacto-yeast extract(酵母提取物)5.0 g，NaCL 10.0 g，瓊脂粉12.5 g，溶解于1 L超純水中，120℃，高壓滅菌20 min。

1.3 RNA 的提取

參照王勛(2011)。一般流程為:取老熟幼蟲1 頭加液研磨、裂解、離心、孵育、洗脫、樣品保存。

1.4 RNA 的反轉(zhuǎn)錄

將樣品加入各種反轉(zhuǎn)錄液、進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，冰上迅速冷卻。

1.5 引物設(shè)計

利用GenBank 上已經(jīng)登錄的幾種吐絲昆蟲輕鏈基因的保守區(qū)域，設(shè)計兩對兼并引物，F(xiàn)ib-LF1:5'-AATGCTGCCCTTCGTTTT-3'，F(xiàn)ib-L-R1:5'-CACCWACGTTGTTACTGCG-3'和Fib-L-F2:5'-CACCWACGTTGTTACTGCG-3'，F(xiàn)ib-L-R2:5'-CACCWACGTTGTTACTGCG-3'，用于擴(kuò)增輕鏈的核心區(qū)域。引物由上海生物工程公司合成。

1.6 基因中間片段的擴(kuò)增

基因中間片段擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μL:

cDNA 2.0 μL

10μM 上游引物 1.25 μL

10μM 下游引物 1.25 μL

2.5 mM dNTP 2 μL

10×PCR Buffer Mg2+plus 4.5 μL

Taq 酶 0.2 μL

ddH2O 13.8 μL

將反應(yīng)液混勻，放入PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 膠回收

切出的目的 DNA 片段放入 1.5 mL 的Microtube 中，加入600 μL 的DR-ⅠBuffer(1mg凝膠視為1μL)，65℃加熱使膠塊完全融化，再加入DR-ⅠBuffer 量的1/2 體積量的DR-ⅡBuffer，均勻混合，離心，最后洗脫DNA。

1.8 體外連接和轉(zhuǎn)化

在Microtube 中配制下列混合液:

回收產(chǎn)物 4.5 μL

連接載體pMD18-T 0.5 μL

SolutionⅠ 5 μL

混合液用槍頭打勻后置于4℃冰箱中，反應(yīng)4 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻打在培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

1.9 菌落篩選和測序

挑取單克隆，在LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，經(jīng)菌液PCR 檢測后含有特異目的基因的陽性克隆菌液，樣品送生工生物工程(上海)有限公司檢測。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過研究探索，成功地釣取到了棉大卷葉螟吐絲基因片段，其長度約為600 bp(圖1-4)。翻譯成的氨基酸序列如圖5 所示。

圖1 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of fibroin light chain(FLC)gene

圖2 膠回收結(jié)果Fig.2 The recovery of PCR product FLC gene

圖3 使用Fib-L-F1 和Fib-L-R1 引物菌液PCR 結(jié)果Fig.3 The result of PCR amplification using the primers of FLC-L-F1 and FLC-L-R1

圖4 棉大卷葉螟吐絲基因片段的測序結(jié)果Fig.4 FLC gene sequence of Sylepta derogata

圖5 棉大卷葉螟吐絲基因片段的氨基酸序列Fig.5 The deduced amino acid sequence of spinning gene fragement from Sylepta derogata

研究結(jié)果顯示，棉大卷葉螟吐絲基因輕鏈片長約在600 bp。將本結(jié)果得到的堿基序列與NCBI上登陸的一些吐絲昆蟲的堿基序列進(jìn)行比對，結(jié)果與外米綴蛾Corcyra cephalonica 的同源性為71%，與大蠟螟Galleria mellonella 的同源性為70%，與家蠶Bombyx mori 的同源性僅為67%。說明棉大卷葉螟的吐絲基因片段有它的個性。

利用(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)估算基因的分子量和等電點(diǎn)，獲得的棉大卷葉螟絲素輕鏈基因相對分子量為53.6 kDa，等電點(diǎn)pI 為5.09。同時利用MEGA軟件將氨基酸序列構(gòu)建基于輕鏈基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖6 所示。

圖6 基于輕鏈基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 The phylogenetic tree based on the deduced amino acid sequences of light chain gene

3 結(jié)論與討論

目前對吐絲昆蟲的研究主要集中在經(jīng)濟(jì)昆蟲、社會性(穴居)昆蟲及蜘蛛類，其目的是利用或模仿這些昆蟲(生物)的吐絲為經(jīng)濟(jì)建設(shè)和國防事業(yè)服務(wù)。而本文則將研究目標(biāo)轉(zhuǎn)移到農(nóng)林有害吐絲昆蟲上，其研究結(jié)果為破解眾多農(nóng)林害蟲的吐絲、結(jié)繭、轉(zhuǎn)移為害機(jī)制提供探索的先例。

本文僅是探討了棉大卷葉螟吐絲基因的輕鏈片段，要把整個棉大卷葉螟的吐絲基因序列包括重鏈基因、P25 基因等(Sutherland et al.，2007)全部描述清楚，還需要一個過程。同時，獲得的這種吐絲基因片段，如何進(jìn)行表達(dá)，甚至利用基因干擾技術(shù)(RNAi)敲除該基因的表達(dá)(王志坤等，2008)、從而達(dá)到控制害蟲吐絲卷葉為害的目的，還有大量的工作需要摸索和闡述清楚。其實(shí)，基因干擾技術(shù)在植物保護(hù)領(lǐng)域的研究與運(yùn)用已初現(xiàn)端倪。唐濤等研究了RNA 干擾對昆蟲抗藥性相關(guān)基因沉默的作用(唐濤等，2010);周慧丹等運(yùn)用RNAi 介導(dǎo)法，將兩種蛋白基因注入棉鈴蟲Helicoverpa armigera 幼蟲體內(nèi)，研究基因沉默后對Cry1Ac 毒力的影響，結(jié)果干擾后的幼蟲對Cry1Ac毒素的敏感性顯著下降(周慧丹等，2010)。王志坤等、牛俊海等分別綜述了RNA 干擾技術(shù)在植物抗病研究、寄生線蟲和根結(jié)線蟲研究中的應(yīng)用(王志坤等，2008;?？『５?，2009);楊中俠等、楊廣等則較全面地綜述了RNAi 技術(shù)在昆蟲研究中的應(yīng)用前景(楊中俠等，2008;何正波等，2009;楊廣等，2009)。因此，有了輕鏈基因片段，為今后進(jìn)一步深入研究和利用生物技術(shù)控制此類害蟲的為害提供了先期基礎(chǔ)。

References)

Chen J，Yang J，Lu PL，et al.Annual life cycle and population dynamics of Sylepta derogata［J］.Plant Protection，2008，34(3):119-122.［陳建，楊進(jìn)，陸佩玲，等.棉大卷葉螟的年生活史與種群動態(tài)［J］.植物保護(hù)，2008，34(3):119-122］

Chen J，Yang J，Zhang XL，et al.Population dynamics of the overwintering generation of Sylepta derogata［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2008，45(5):735-738.［陳建，楊進(jìn)，張小麗，等.越冬代棉大卷葉螟的種群動態(tài)［J］.昆蟲知識，2008，45(5):735-738］

Huang DL，Liu HQ.Resistance of three transgenic cotton varieties to Sylepta derogata［J］.Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，2005，21(2):98-101.［黃東林，劉漢勤.三種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對棉大卷葉螟的抗性［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，21(2):98-101］

He ZB，Chen B，F(xiàn)eng GZ.RNA interference and its application in Entomology［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2009，46(4):525-532.［何正波，陳斌，馮國忠.昆蟲RNAi 技術(shù)及其應(yīng)用［J］.昆蟲知識2009，46(4):525-532］

Liu F，Yang YZ，Lu YH，et al.Effects of the transgenic Bt cotton on population dynamics of the cotton leaf-roller Sylepta derogata［J］.Entomological Knowledge，2005，42(3):275-277.［劉芳，楊益眾，陸宴輝，等.轉(zhuǎn)Bt 基因棉對棉大卷葉螟種群動態(tài)的影響［J］.昆蟲知識，2005，42(3):275-277］

Kang XX，Chen J，Wang CC，et al.Identification and behaviors of parasitoids of Sylepta derogata in the Yangtze River and Huihe Valley［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2006，43(5):663-666.［康曉霞，陳建，王常春，等.江淮棉區(qū)棉大卷葉螟主要寄生性天敵的寄生作用［J］.昆蟲知識，2006，43(5):663-666］

Kang XX，Yang YZ，Zhao GG，et al.Parasitic behavior of Apanteles derogatae Watanabe and its relation to the density of Sylepta derogata Fabrieius［J］.Acta Phytophylacica Sinica，2007，34(1):22-26.［康曉霞，楊益眾，趙光明，等.卷葉螟絨繭蜂寄生棉大卷葉螟的行為及其與寄主密度的關(guān)系［J］.植物保護(hù)學(xué)報，2007，34(1):22-26］

Kang XX，Zhao GM，Gong YF，et al.Biological characteristics of adult Apanteles opacus，a parasitoid of Sylepta derogata［J］.Chinese Journal of Biological Control，2006，22(4):275-278.［康曉霞，趙光明，龔一飛，等.棉大卷葉螟絨繭蜂生物學(xué)特性觀察［J］.中國生物防治，2006，22(4):275-278］

Lu PL，Chen J，Zhang XL，et al.Study on biological habit of cotton leaf roller［J］.Anhui Agricultural Science Bulletin，2008，14(20):92-94.［陸佩玲，陳建，張小麗，等.棉大卷葉螟主要生物學(xué)習(xí)性研究［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14(20):92-94］

Niu JH，Guo YD，Jian H.Progress in the study of RNAi mediated plant root-knot nematodes resistant genetic engineering［J］.Genomics and Applied Biology，2009，28(1):167-173.［?？『?，郭仰東，簡恒.RNA 干擾在植物抗根結(jié)線蟲病基因工程應(yīng)用中的研究進(jìn)展［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(1):167-173］

Lu PL，Yang YZ.Overwintering strategies of the cotton leaf-roller，Sylepta derogata F.(Lepidoptera:Pyralidae)［J］.Oriental Insects，2011，1:1-6.

Tang T，Liu XY，Qiu LH.RNA Interference and its applications on silencing of insecticide-resistant genes in insects［J］.Cotton Science，2010，22(6):617-624.［唐濤，劉雪源，邱立紅.RNA 干擾及其對昆蟲抗藥性相關(guān)基因的沉默研究［J］.棉花學(xué)報，2010，22(6):617-624］

Tara D，Sutherland JH，Young AS，et al.An independently evolved Dipteran silk with features common to Lepidopteran silks［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2007，37:1036-1043.

Wang SP，Sun X.Research progress of gene expression regulation of silkworm silk protein［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2009，37(28):13514-13518.［汪生鵬，孫霞.家蠶蠶絲蛋白基因表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(28):13514-13518］

Wang Xun.Cloning and Expression of CsAQP1 Genes in Rice Stem Borer，Chilo suppressalis Walker(Lepidoptera:Pyralidae)［D］.Yangzhou:Yangzhou University，2011.［王勛.水稻二化螟CsAQP1 基因的克隆與表達(dá)［D］.揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué)碩士論文，2011］

Wang HZ，Xiao YL，Zheng CM，et al.Studies on the resistance of Bt transgenic cotton to cotton leaf roller(Sylepta derogata Fabricius)［J］.Plant Protection Technology and Extension，2002，22(3):21-22.［王厚振，肖云麗，鄭成民，等.轉(zhuǎn)Bt 基因抗蟲棉對棉大卷葉螟抗性的研究［J］.植保技術(shù)與推廣，2002，22(3):21-22］

Wang ZK，Li WB，Liu SS.Technology of RNAi and its application in disease resistance of plant［J］.Soybean Science，2008，27(3):521-526.［王志坤，李文濱，劉珊珊.RNA 干擾技術(shù)及在植物抗病研究中的運(yùn)用［J］.大豆科學(xué)，2008，27(3):521-526］

Yang ZX，Wen LZ，Wu QJ.Application of RNA interference in studying gene functions in insects［J］.Acta Entomologica Sinica，2008，51(10):1077-1082.［楊中俠，文禮章，吳青軍.RNAi 技術(shù)在昆蟲功能基因研究中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.昆蟲學(xué)報，2008，51(10):1077-1082］

Yang G，You MS，Zhao YY，et al.RNA interference in insect［J］.Acta Entomologica Sinica，2009，52(10):1156-1162.［楊廣，尤民生，趙伊英，等.昆蟲的RNA 干擾［J］.昆蟲學(xué)報，2009，52(10):1156-1162］

Zhou HD，Yang YH，Wu YD.Effects of RNAi-mediated silencing of an am inopeptidase N gene Haapnl and a cadherin gene HaBtR on Cry1Actoxicity against Helicoverpa armigera(Lepidoptera:Noctuidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2010，53(10):1097-1103.［周慧丹，楊亦樺，吳益東.RNAi 介導(dǎo)的棉鈴蟲氨肽酶N 基因Haapnl 和鈣粘蛋白基因HaBtR 沉默對Cry1Ac毒力的影響［J］.昆蟲學(xué)報，2010，53(10):1097-1103］