馬 琳，楊子祥，唐翊峰，劉 平

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所，國(guó)家林業(yè)局資源昆蟲(chóng)培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

蚜蟲(chóng)屬半翅目Hemiptera，蚜總科Aphidoidea，是一類(lèi)植食性昆蟲(chóng)，目前已經(jīng)報(bào)道約5000種(Blackman and Eastop，2013)，其中有400 多種能刺激植物組織增生，形成蟲(chóng)癭(張合彩等，2006)。與其他大多數(shù)咀嚼式口器的昆蟲(chóng)不同，蚜蟲(chóng)為刺吸式口器，其口器特化為針狀，內(nèi)部包含兩個(gè)管道，食物管道和唾液管道，其中食物管道將植物木質(zhì)部或韌皮部篩狀結(jié)構(gòu)中營(yíng)養(yǎng)豐富的汁液輸送到蚜蟲(chóng)的消化系統(tǒng)，唾液管道則將蚜蟲(chóng)唾液注入植物組織，當(dāng)蚜蟲(chóng)取食時(shí)，正是通過(guò)這兩條管道實(shí)現(xiàn)昆蟲(chóng)與植物之間液體物質(zhì)的交流(Miles，1999)。蚜蟲(chóng)大多數(shù)是害蟲(chóng)，如棉蚜Aphis gossypii、麥長(zhǎng)管蚜Macrosiphum avenae、桃蚜Myzus persicae 等為重要的農(nóng)林害蟲(chóng);但少數(shù)種類(lèi)對(duì)人類(lèi)有益，如五倍子蚜是重要資源昆蟲(chóng)，由其寄生在鹽膚木等植物上形成的蟲(chóng)癭，稱(chēng)為五倍子，是重要的化工和醫(yī)藥原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

蚜蟲(chóng)的唾液是蚜蟲(chóng)與植物相互作用的媒介，其主要成分是氨基酸和各種酶類(lèi)，如果膠酶、多酚氧化酶、纖維素酶和淀粉酶等(Ma et al.，1998;Urbanska et al.，1998;Miles，1999)，在克服寄主植物的防御反應(yīng)、幫助取食和消化、食物解毒等方面發(fā)揮著非常重要的作用(Miles and Peng，1989);蚜蟲(chóng)唾液中可能還含有特殊的活性物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)植物組織異常增生形成蟲(chóng)癭。因此，對(duì)蚜蟲(chóng)唾液的提取和成分分析，有助于深入理解唾液在誘導(dǎo)和克服植物抗性反應(yīng)的機(jī)理、探索蟲(chóng)癭形成的關(guān)鍵因子，對(duì)作物抗蚜品種選育、防治技術(shù)開(kāi)發(fā)和蟲(chóng)癭形成機(jī)理研究等具有重要意義。目前蚜蟲(chóng)唾液的研究方法主要是雙層膜夾營(yíng)養(yǎng)液法收集，經(jīng)過(guò)濃縮及質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析，然后通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和鑒定。

由于蚜蟲(chóng)個(gè)體微小，體長(zhǎng)一般僅為0.5-0.6 mm，體重為10-300 ug(趙惠燕，1988)，并且若蚜壽命一般較短，有些種類(lèi)的若蚜僅在特定階段產(chǎn)生等，給唾液的收集和分析帶來(lái)了很大困難。雖然雙層膜收集唾液的方法在上世紀(jì)60年代中期就已經(jīng)基本成熟，但在過(guò)去的近50年中，僅在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum、麥二叉蚜Schizaphis graminum、桃蚜等少數(shù)種類(lèi)上獲得了成功(Madhusudhan and Miles，1998;Cherqui and Tjallingii，2000;陳巨蓮等，2000;郭光喜等，2006;Carolan et al.，2009;Rao et al.，2013)，其中的技術(shù)難點(diǎn)一是唾液的收集，二是唾液提取液的濃縮方法。

本研究以五倍子蚜的主要種類(lèi)角倍蚜Schlechtendalia chinensis 為材料，根據(jù)角倍蚜干雌個(gè)體微小和體表有蠟粉等特點(diǎn)對(duì)唾液的提取和濃縮方法進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，改進(jìn)的方法能夠提取到足夠數(shù)量的唾液并鑒定蛋白成分。

1 材料與方法

1.1 蚜蟲(chóng)

供試角倍蚜來(lái)源于云南鹽津，為角倍蚜自然分布區(qū)。8月在林間采集新鮮角倍蚜蟲(chóng)癭，帶回室內(nèi)剖開(kāi)，取出蟲(chóng)癭內(nèi)的干雌，去除蠟粉，置于培養(yǎng)皿內(nèi)饑餓24 h 后，用于唾液提取。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器

兩端開(kāi)口的圓玻璃管(Φ 3 cm，h 3.5 cm)，Parafilm 膜(PM-996)，Airtech 超凈工作臺(tái)，Sanyo Labo Autoclave 全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器，F(xiàn)orma-80℃ 冰箱，Sigma 3K30 冷凍離心機(jī)，Thermo FRESco21 微量冷凍離心機(jī)，Christ ALPHA 1-2 LD plus 冷凍干燥儀，Eppendorf 真空離心濃縮儀，Bio-Rad SmartSpec Plus 核酸蛋白測(cè)定儀，Electrophoresis power supply-EPS 301 垂直電泳體系，UMAX Powerlook 2100XL 掃描儀，DHP 9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，ELGA Purelab Ultra 超純水系統(tǒng)，Thermo Q-Exactive 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，分離柱C18(150 mm×0.18 mm，3 μm)。

1.2.2 試劑

通用蛋白質(zhì)沉淀劑(上海生工)，尿素、CHAPS、Pharmalyte pH 3-10、二硫蘇糖醇(DTT)(GE Healthcare)，蛋白酶抑制劑(羅氏)，牛血清蛋白(BSA)、蛋白定量染料、碘乙酰胺(IAA)(Bio-Rad)，SDS-PAGE 凝膠電泳試劑(USB)，蛋白質(zhì)Marker、甲酸(FA)(Thermo Fisher)，胰蛋白酶(trypsin)(Promega)，乙腈(ACN)(Sigma)，三氟乙酸(TFA)(Acros)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 唾液收集

1.3.1 營(yíng)養(yǎng)液準(zhǔn)備

無(wú)菌水:取超純水(＞18.2 MΩ)，高壓滅菌后置于4℃冰箱中保存，保存期7 d 以下。

1.3.2 雙層膜夾營(yíng)養(yǎng)液

將Parafilm 膜剪成小方塊，用75%酒精浸泡過(guò)夜后在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出、晾干，并在紫外燈下照射滅菌1 h。用雙手拉住膜的兩側(cè)，慢慢向兩邊拉伸，直至膜逐漸變薄透明時(shí)，小心將膜覆蓋在玻璃管管口上，壓實(shí)。用注射器吸取適量營(yíng)養(yǎng)液，用針頭式過(guò)濾器(Φ 0.2 um)過(guò)濾后注射到膜的中央位置。然后在營(yíng)養(yǎng)液上覆上第2 層膜，覆蓋時(shí)稍拉伸，使兩層膜緊密接觸，適當(dāng)擠壓營(yíng)養(yǎng)液使其在兩層膜間鋪滿，并避免產(chǎn)生氣泡，在第2 層膜上再覆蓋一層保護(hù)膜。

1.3.3 蚜蟲(chóng)取食

將蓋有營(yíng)養(yǎng)液的玻璃管懸空放置，營(yíng)養(yǎng)液一端朝下。從另一端放入角倍蚜干雌，至基本鋪滿取食膜的表面，數(shù)量約為1000-1200 頭/管，蓋上透氣的紗布。置于人工氣候室內(nèi)，調(diào)節(jié)溫度為20℃，相對(duì)濕度90%，在玻璃管營(yíng)養(yǎng)液一端放置黃色光源，吸引蚜蟲(chóng)集中到膜的表面取食，持續(xù)24 h。

1.3.4 唾液收集

將玻璃管反轉(zhuǎn)，倒出蚜蟲(chóng)，從外側(cè)小心去掉營(yíng)養(yǎng)液袋的外層保護(hù)膜。用注射器針頭在第2 層膜上扎一個(gè)小孔，緩慢地吸出含有唾液的營(yíng)養(yǎng)液。每管約收集100 μL，轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管內(nèi)，-80℃保存。重復(fù)上述過(guò)程，多次收集并將唾液收集液合并，共收集3 批次，每批次為240 管約24 mL，用于后續(xù)分析。

1.4 唾液收集液的濃縮和蛋白檢測(cè)

1.4.1 濃縮

1.4.1.1 超濾膜濃縮

將合并后的唾液收集液轉(zhuǎn)移到截留分子量(MWCO)5000 的超濾管內(nèi)，7500×g，4℃，離心30 min。轉(zhuǎn)移濃縮液至MWCO 3000 的超濾管內(nèi)，10000×g，4℃，離心50 min。轉(zhuǎn)移濃縮液至1.5 mL 離心管內(nèi)，加100 μL 裂解液和5 μL 蛋白酶抑制劑，渦旋混勻。真空離心濃縮，30℃，熱干40 min。濃縮液終體積約為100 μL。

1.4.1.2 真空冷凍干燥法

將合并后的唾液收集液置于50 mL 離心管中，-80℃速凍成固態(tài)。轉(zhuǎn)移到冷凍干燥儀內(nèi)，真空冷凍干燥。設(shè)置參數(shù)為:0.024 mbar，-54℃，至完全干燥為粉末狀。加100 μL 去離子水溶解。

1.4.1.3 沉淀法

取10 mL 離心管24 支，每管分別加入1 mL 唾液收集液，根據(jù)沉淀劑作用說(shuō)明，按1∶3 的體積比先加入3 mL 沉淀劑一，渦旋振蕩30 s，冰上孵育10 min;再加入3 mL 沉淀劑二，渦旋振蕩30 s，冰上孵育10 min。4℃，22000×g，離心5 min。吸出上清液，加入100 μL 去離子水溶解。

1.4.2 蛋白檢測(cè)

1.4.2.1 Bradford 法定量檢測(cè)

采用Bio-Rad 蛋白測(cè)定儀，選擇Protein 程序下Bradford 法。以 15.0 mg/mL 牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用蛋白定量染料分別稀釋10、13.3、20、40 和100 倍，在595 nm 處測(cè)定各管的OD 值。形成以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.9927。取20 μL

1.4.1 樣品濃縮液用蛋白定量染料按2、5、10 倍的濃度梯度稀釋?zhuān)瑴y(cè)定595 nm OD 值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品的蛋白濃度。

1.4.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用垂直電泳儀進(jìn)行1-DE。每泳道上樣量20 μL，包括10 μL 蛋白濃縮液、8 μL 蛋白上樣緩沖液2×和2 μL β-巰基乙醇，混勻，沸水浴3 min，冷卻至室溫。配制分離膠濃度為13%，濃縮膠濃度為4%。以等體積去離子水為陰性對(duì)照，10 μL Marker 作為陽(yáng)性對(duì)照。恒流電泳，濃縮膠內(nèi)電流為15 mA，運(yùn)行時(shí)間為30 min;分離膠內(nèi)電流30 mA，運(yùn)行時(shí)間約為1 h。當(dāng)溴酚藍(lán)前沿到達(dá)分離膠底部時(shí)，停止電泳。分別進(jìn)行銀染和考馬斯亮藍(lán)染色、脫色。膠板掃描圖采用MagicScan 5.1成像和分析。

1.4.3 質(zhì)譜分析

1.4.3.1 質(zhì)譜前樣品處理

1.4.3.1.1 溶液酶解(in-solution digestion)

在50 μL 唾液濃縮液中加100 mM 的碳酸氫銨，調(diào)節(jié)pH 值在8-9 范圍內(nèi)。加1 M 的二硫蘇糖醇至終濃度為10 mM，56℃水浴1 h。繼續(xù)加1 M的碘乙酰胺至終濃度為50 mM，室溫下暗反應(yīng)1 h。按1∶50(V/V)加0.5 ug/uL 胰蛋白酶(trypsin)，37℃恒溫培養(yǎng)16 h，用于質(zhì)譜檢測(cè)。

1.4.3.1.2 膠內(nèi)酶解(in-gel digestion)

以銀染膠板上的目的條帶位置為參照，在考染膠的相同位置用干凈刀片切割膠條并切碎，轉(zhuǎn)移膠粒到離心管內(nèi)，加入適量乙腈(以浸過(guò)膠粒為限)，脫水干燥。吸出乙腈，加30-50 μL 10 mM二硫蘇糖醇，56℃水浴1 h。加與二硫蘇糖醇等體積的50 mM 碘乙酰胺，室溫下暗反應(yīng)1 h。吸出液體，加適量乙腈(以浸過(guò)膠粒為限)，5-10 min 脫水干燥。加4-7 μL 15 ng/μL 的胰蛋白酶，4℃放置30 min。再加30-50 μL 25 mM 碳酸氫銨，37℃恒溫培養(yǎng)16 h。加30-50 μL 50%乙腈和5%三氟乙酸的混合液，37℃恒溫提取1 h。吸出液體，重復(fù)提取一次。吸出液體，真空離心干燥。加10 μL 液相A 液:98% 水、2% 乙腈，0.1%甲酸重溶，12000×g 離心，取上清液用于質(zhì)譜檢測(cè)。

1.4.3.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)(LC-MS/MS)

取1.4.3.1 酶解產(chǎn)物，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。分離柱為C18，流動(dòng)相為濃度梯度為5-95%乙腈，流速:200 nL/min，時(shí)間:45 min。

1.5 蛋白鑒定

采用Mascot 檢索方法，對(duì)1.4.3 LC-MS/MS的分析結(jié)果進(jìn)行蛋白檢索比對(duì)。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)包括UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org)和豌豆蚜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)ACYPI proteins V2.1b(http://www.aphidbase.com/aphidbase/downloads)。用 于肽段/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的基因組序列和數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)自 Human Genome Sequencing Centre at Baylor College of Medicine(www.hgsc.bcm.tmc.edu)和International Aphid Genomics Consortium(www.aphidbase.com)。搜索參數(shù)設(shè)置:Peptide Mass Tolerance:±0.1 Da，F(xiàn)ragment Mass Tolerance:±0.2 Da，Max Missed Cleavages:2。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 Bradford 法定量檢測(cè)

經(jīng)Bradford 法定量檢測(cè)，超濾膜法濃縮液樣品的蛋白濃度為0.15 ug/uL;沉淀劑法和真空冷凍干燥法濃縮液樣品，沒(méi)有檢測(cè)出蛋白(表1)。表明超濾膜法濃縮液中含有蛋白，且濃度已達(dá)到質(zhì)譜分析要求，而沉淀劑法和真空冷凍干燥法不適合于角倍蚜唾液提取液的濃縮。

2.1.2 聚丙酰胺凝膠電泳檢測(cè)(SDS-PAGE)

經(jīng)垂直板電泳(1-DE)檢測(cè)，超濾膜法濃縮液樣品的銀染膠，在蛋白分子量為45-116 kDa范圍內(nèi)出現(xiàn)5 條較淺的條帶，考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)條帶;沉淀劑法和真空冷凍干燥法濃縮液樣品，銀染和考馬斯亮藍(lán)染色均沒(méi)有檢測(cè)出條帶。表明超濾膜法濃縮的唾液提取液中含有蛋白，但濃度較低，僅達(dá)到銀染檢測(cè)的濃度范圍，而其他兩種濃縮方法不適合于角倍蚜唾液提取液的濃縮。

2.1.3 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析(LC-MS/MS)

經(jīng)LC-MS/MS 分析，超濾膜法濃縮液的質(zhì)譜圖上有蛋白質(zhì)峰(圖1)，而真空冷凍干燥法濃縮液沒(méi)有檢測(cè)出蛋白質(zhì)峰，沉淀劑法濃縮液中雖然檢測(cè)出質(zhì)譜峰，但經(jīng)鑒定不是蛋白質(zhì)峰(表1)，而是聚山梨酯-80(Tween-80)，系沉淀劑的成分之一，沉淀劑成分的殘留可能影響了唾液蛋白的檢測(cè);真空干燥法可能是凍融過(guò)程中發(fā)生了蛋白質(zhì)降解，因此濃縮后未能檢測(cè)出蛋白成分。表明3種濃縮方法中，只有超濾膜法適用于角倍蚜唾液提取液的濃縮。

表1 角倍蚜干雌唾液收集液不同濃縮方法的蛋白檢測(cè)結(jié)果Table 1 Saliva protein detection of Schlechtendalia chinensis by different concentration methods

圖1 角倍蚜干雌唾液蛋白的LC-MS/MS 圖Fig.1 MS spectrogram of Schlechtendalia chinensis saliva proteins

2.2 蛋白鑒定

對(duì)考染膠板44-66.2 kDa 的一條濃度較深的條帶的液質(zhì)聯(lián)用分析，與豌豆蚜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)檢索到31種蛋白，與角倍蚜干雌唾液腺蛋白鑒定結(jié)果比對(duì)，其中有11個(gè)蛋白為共有蛋白;在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到15種蛋白。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)比對(duì)，檢索到的蛋白中有5種與唾液功能有關(guān)。表明角倍蚜干雌的唾液提取液中獲得了有效的唾液蛋白成分。

3 結(jié)論與討論

蚜蟲(chóng)唾液收集和分析是一個(gè)技術(shù)性高的精細(xì)工作，需要按程序逐步操作，每一步失誤都有可能導(dǎo)致收集或分析失敗，對(duì)于體型較小的蚜蟲(chóng)種類(lèi)更是如此，其中唾液收集、濃縮及防止唾液蛋白降解是唾液研究的關(guān)鍵。

(1)唾液收集。只有收集到足夠量的唾液，才有可能進(jìn)行唾液蛋白的檢測(cè)和鑒定。在唾液收集中的關(guān)鍵技術(shù)包括:①Parafilm 膜的拉伸。只有將膜拉得足夠薄，蚜蟲(chóng)的口針才能穿過(guò)膜取食，從而收集到唾液。但如果膜拉伸得過(guò)薄，則容易破裂。因此要通過(guò)多次練習(xí)，掌握合適的拉伸度。②取食管的選擇。有的研究采用直徑3 cm 的小玻璃管或PVC 管，每管收集唾液40-120 μL(Cherqui and Tjallingii，2000;Habibi et al.，2001;Harmel et al.，2008);另外一些研究采用直徑8 cm的大管，每管約收集唾液5 mL(Rao et al.，2013;Carolan et al.，2009)。通過(guò)對(duì)兩種大小玻璃管的比較發(fā)現(xiàn)，直徑3 cm 的小管更容易掌控膜的拉伸度，收集唾液時(shí)不易引起膜的破裂。③營(yíng)養(yǎng)液的選擇。營(yíng)養(yǎng)液不僅會(huì)影響蚜蟲(chóng)的取食行為，還會(huì)影響唾液的成分(Miles and Harrewijin，1991;殷海娣等，2006)。蒸餾水和蔗糖溶液是蚜蟲(chóng)唾液收集中采用最多的營(yíng)養(yǎng)液(Miles and Harrewijin，1991;Tjallingii and Cherqui，1999;Wang YC et al.，2008;Harmel et al.，2008)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)采用15%蔗糖溶液和無(wú)菌水作為營(yíng)養(yǎng)液時(shí)，收集的角倍蚜干雌唾液濃度沒(méi)有顯著差異，因此本研究中采用無(wú)菌水作為營(yíng)養(yǎng)液。對(duì)于其他濃度的蔗糖溶液對(duì)角倍蚜干雌的唾液收集效果，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)。

(2)唾液收集液的濃縮。角倍蚜個(gè)體微小，需要將大量的唾液收集液合并后才能達(dá)到質(zhì)譜分析的濃度要求。合并后的唾液收集液體積增大，但唾液蛋白濃度低，需要經(jīng)過(guò)濃縮才能達(dá)到質(zhì)譜分析要求的濃度，因此濃縮方法的選擇也很重要。本研究表明，與沉淀劑法和真空冷凍干燥法相比，超濾膜法操作簡(jiǎn)便，蛋白損失較少，沒(méi)有引入外來(lái)物質(zhì)，是適合角倍蚜唾液提取液濃縮的有效方法。

(3)防止唾液蛋白的降解。由于唾液中本身含有消化酶，在收集唾液的過(guò)程中要從以下兩個(gè)方面防止唾液蛋白的降解。①取食時(shí)間。本研究設(shè)置角倍蚜的取食時(shí)間為24 h。既保證饑餓后的蚜蟲(chóng)有充分的取食時(shí)間，又能避免取食時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致蛋白降解。②加裂解液變性。裂解液能夠?qū)⑼僖旱鞍鬃冃?，避免其降解。變性后的蛋白并不影響蛋白種類(lèi)鑒定。因本實(shí)驗(yàn)旨在鑒定角倍蚜唾液中的蛋白種類(lèi)，并不對(duì)唾液蛋白進(jìn)行功能性驗(yàn)證。

在以前的蚜蟲(chóng)唾液研究中，唾液提取成功的種類(lèi)如豌豆蚜、麥二叉蚜和桃蚜等均為自由生長(zhǎng)的蚜蟲(chóng)，人工飼養(yǎng)相對(duì)容易，且個(gè)體較大。本研究的角倍蚜為個(gè)體較小的致癭蚜蟲(chóng)，通過(guò)對(duì)現(xiàn)有唾液提取和濃縮方法的改進(jìn)和優(yōu)化，成功提取和鑒定出角倍蚜干雌的唾液成分，改進(jìn)的方法不僅可用于其他體型較小蚜蟲(chóng)的唾液提取，也可為癭蚜的唾液提取和分析提供借鑒。

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