張道偉，陳 靜，袁 媛，楊 靜，錢(qián)正敏

(1.遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，貴州省赤水河流域動(dòng)物資源保護(hù)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563002;2.遵義醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室，貴州遵義 563003)

德國(guó)小蠊Blattella germanica 在分類學(xué)上隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)Arthopoda，昆蟲(chóng)綱Insecta，蜚蠊目Blattaria，是重要的城市環(huán)境衛(wèi)生害蟲(chóng)之一，可攜帶多種病原菌，導(dǎo)致多種疾病的傳播和引起哮喘等過(guò)敏反應(yīng)，給人類的健康和生活質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重影響(Oliva，et al.，2010;張凡，2011)。德國(guó)小蠊種群密度大，繁殖速度快，對(duì)殺蟲(chóng)劑的高抗性使德國(guó)小蠊的防治成為世界性的防治難題，給疾病預(yù)防與控制工作帶來(lái)極大的困難(趙志剛等，2012)。隨著人們對(duì)食品安全和環(huán)境意識(shí)的提高以及可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，人們?cè)絹?lái)越需要一種新型環(huán)保的措施治理德國(guó)小蠊。

幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)表皮和昆蟲(chóng)中腸圍食膜的必需組份，對(duì)昆蟲(chóng)的發(fā)育至關(guān)重要。在進(jìn)化過(guò)程中，昆蟲(chóng)利用幾丁質(zhì)的剛性和化學(xué)穩(wěn)定性，形成其細(xì)胞外骨架如外表皮和中腸內(nèi)壁的圍食膜結(jié)構(gòu)，從而保護(hù)昆蟲(chóng)在生長(zhǎng)、移動(dòng)和與外界交流等過(guò)程中免受環(huán)境中的各種傷害(Kramer and Muthukrishnan，2005)。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)過(guò)程中的重要作用，加之高等動(dòng)物和植物中均不含幾丁質(zhì)，因此干擾幾丁質(zhì)的合成和降解，一直是新型農(nóng)藥靶標(biāo)研究的熱點(diǎn)。

幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)是降解幾丁質(zhì)的主要酶類之一，在自然界的存在范圍也極為廣泛。在昆蟲(chóng)中的主要功能是周期性的褪去舊表皮過(guò)程中降解幾丁質(zhì)。昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶的研究始于19 世紀(jì)70年代，第一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因cDNA 的克隆由Kramer 于1993年從煙草天蛾Manduca sexta 中獲得。隨后又有眾多的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因的cDNA 序列從昆蟲(chóng)不同目的物種中被分離。目前已報(bào)道的幾丁質(zhì)酶主要集中在鱗翅目昆蟲(chóng)(Kim et al.，1998;Bolognesi et al.，2005;Zhang et al.，2012)、雙翅目昆蟲(chóng)(Feix et al.，2000，Yan et al.，2002)，而鞘翅目(Royer et al.，2002，Genta et al.，2006)及膜翅目昆蟲(chóng)(Krishnan et al.，1994)等也有少量報(bào)道。在已報(bào)道的這些昆蟲(chóng)中，一般只有一個(gè)基因或cDNA 序列被鑒定出來(lái)。近年來(lái)隨著越來(lái)越多昆蟲(chóng)基因組序列測(cè)序工作的完成，利用生物信息學(xué)方法鑒別出多個(gè)幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶基因。Zhu 等2004 首先在果蠅Drosophila melanogaster 基因組發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)幾丁質(zhì)酶或類幾丁質(zhì)酶成員并初步將其分類。隨后Zhu 等(2008a)進(jìn)一步通過(guò)搜索D.melanogaster、赤擬谷盜Tribolium castaneum和埃及伊蚊Aedes aegypti 基因組序列，結(jié)果顯示分別有23、17 和16個(gè)幾丁質(zhì)酶或類幾丁質(zhì)酶家族基因被識(shí)別出來(lái)。Pan 等(2012)重新搜索家蠶基因組也發(fā)現(xiàn)有12個(gè)幾丁質(zhì)酶或類幾丁質(zhì)酶被鑒定出來(lái)，說(shuō)明在昆蟲(chóng)中幾丁質(zhì)酶是一個(gè)多基因家族成員。識(shí)別出來(lái)的幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶基因通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)重組蛋白(Zhu et al.，2008b)和注射幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA 的RNAi 實(shí)驗(yàn)(Zhu et al.，2008c)進(jìn)一步得到功能上的鑒定;不同類型的幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)受到抑制后，會(huì)出現(xiàn)畸形發(fā)育、死亡等各種表型(Zhu et al.，2008c;Zhang et al.，2012)，顯示幾丁質(zhì)酶在昆蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的具有重要功能。這些研究表明利用幾丁質(zhì)酶在不同害蟲(chóng)防治應(yīng)用有著良好的前景。本研究根據(jù)幾丁質(zhì)酶保守序列結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從德國(guó)小蠊中克隆到其BgChi 基因的全長(zhǎng)cDNA 序列，并進(jìn)一步對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、組織和時(shí)間表達(dá)特異性進(jìn)行了分析，本研究結(jié)果為利用幾丁質(zhì)酶基因?yàn)榘袠?biāo)防治德國(guó)小蠊奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 德國(guó)小蠊的飼養(yǎng)

德國(guó)小蠊由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院張春林教授惠贈(zèng)，在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)多代。飼養(yǎng)條件為溫度25℃±1℃，光照條件為14L∶10D，相對(duì)濕度為70%-80%，用大鼠飼料繼代飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器

SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit、定量PCR 試劑(SYBR Premix Ex Taq)、pMD-18T Cloning Vector 購(gòu)自寶生物(大連)有限公司，TransTaqTMHiFi DNA Polymerase 購(gòu)自北京全式金生物公司，AxyPrep 質(zhì)粒小量制備試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物公司，所有引物合成和序列測(cè)序由上海生物工程有限公司完成。常規(guī)PCR 儀PTC-1000、定量PCR 儀CFX96 和凝膠電泳系統(tǒng)購(gòu)自Bio-rad公司、凝膠成像系統(tǒng)GelDoc-IT 購(gòu)自美國(guó)Springsci 公司。

1.1.3 本研究采用的引物序列及作用

表1 德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶基因cDNA 擴(kuò)增的策略和引物Table 1 Strategy and primers used for amplification chitinase gene cDNA in Blattella germanica

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 的提取、cDNA 合成和PCR 反應(yīng)

采用Trizol 方法提取德國(guó)小蠊從卵發(fā)育至成蟲(chóng)時(shí)期的總RNA。步驟如下:將樣品放入液氮預(yù)冷的無(wú)RNase 的研缽，研磨至粉末狀，加1 mL Trizol，繼續(xù)研磨至液體;轉(zhuǎn)入1.5 mL EP 管，渦旋震蕩15 s，室溫靜置5 min;加入0.2 mL 氯仿，混勻靜置3-5 min，4℃，12000 g，15 min;轉(zhuǎn)移上清至新的EP 管中，加入0.5 mL 異丙醇，室溫靜置10 min，4℃，12000 g 離心10 min;棄上清，加入1 mL 75% 乙醇洗滌沉淀，4℃，7500 g，5 min，棄上清;稍微干燥，用適量無(wú)RNase 的去離子保存。

首先用Nano drop-2000 微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度，然后再0.2 mL PCR 管中按順序加入以下樣品:1 μg 總RNA，5 μL 的5×Buffer，2 μL的dNTPs，0.5 μL 的AMV RTase，1 uL 引物dT18，補(bǔ)充DEPC 水至25 uL。在PCR 儀上進(jìn)行如下反應(yīng):37℃，10 min;42℃，1.5 h;90℃，5 min，即獲得第一鏈cDNA。兩對(duì)簡(jiǎn)并引物BgChi-F1，BgChi-F2，BgChi-R1 和BgChi-R2 根據(jù)已知昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因的保守序列設(shè)計(jì)。中間片段獲得由兩輪PCR 組成，第一輪PCR 采用BgChi-F1 和BgChi-R1 為引物，進(jìn)行如下反應(yīng):預(yù)變性94℃，5 min;然后30個(gè)循環(huán)94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min;第二輪PCR 采用BgChi-F2 和BgChi-R2 為引物，模板為第一輪PCR 產(chǎn)物稀釋50 倍，進(jìn)行如下反應(yīng):預(yù)變性94℃，5 min;然后30個(gè)循環(huán)94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，40 s。

1.2.2 目的片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證

將第二輪PCR 產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收合適的大小片段，根據(jù)pMD-18T Cloning Vector 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)入DH 5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，用BgChi-F2 和BgChi-R2 為引物進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆搖菌，送樣品到上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 BgChi 的3' RACE 和5'RACE 擴(kuò)增

根 據(jù) Clontech 的 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)分別構(gòu)建了德國(guó)小蠊整個(gè)發(fā)育時(shí)期(卵、1-6 齡幼蟲(chóng)、雌成蟲(chóng)、雄成蟲(chóng)等)的5'RACE 和3'RACE cDNA 庫(kù)。特異性引物BgChi-3' GSP1 和BgChi-3' GSP2 以 及BgChi-5'GSP1 和BgChi-5'GSP2 根據(jù)獲得的中間片段設(shè)計(jì)。其中BgChi-3'GSP1 和BgChi-3'GSP2用于擴(kuò)增3' RACE 片段，第一輪 PCR 采用BgChi-3'GSP1 和UPM 引物，第二輪巢氏PCR 采用BgChi-3'GSP2 和NUP 引物進(jìn)行擴(kuò)增，作為模板第一輪PCR 產(chǎn)物稀釋50 倍;BgChi-5'GSP1 和BgChi-5'GSP2 用于擴(kuò)增5'RACE 片段，第一輪PCR 采用BgChi-5'GSP1 和UPM 引物，第二輪巢氏PCR 采用BgChi-5'GSP2 和NUP 引物進(jìn)行擴(kuò)增，作為模板第一輪 PCR 產(chǎn)物稀釋50 倍。RACE-PCR 擴(kuò)增的程序均為:預(yù)變性94℃，5 min;然后30個(gè)循環(huán)94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min。獲得的片段采用與方法1.2.2 相同的步驟進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證。

1.2.4 序列分析

德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶基因BgChi 核苷酸序列分析軟件采用DNAstar 軟件分析，其它物種幾丁質(zhì)酶從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得;蛋白質(zhì)功能域的搜索用Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi);信號(hào)肽采用 SignaIP 進(jìn)行預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);結(jié)構(gòu)域分析采用 Swiss-Model(http://smart.embl-heidelberg.de/);跨膜結(jié)構(gòu)TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);核苷酸序列和氨基酸序列搜索采用在線分析工具blastn 和blastp;進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建采用軟件Clustalw2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)和MEGA 5.1。

1.2.5 組織分布和時(shí)間表達(dá)檢測(cè)

取德國(guó)小蠊6 齡3 d(盧慧明等，2013)幼蟲(chóng)的不同組織(包括表皮、脂肪體、中腸、氣管、血淋巴)，6 齡蛻皮前1-3 d 和蛻皮后1-5 d 收集樣品。按照1.2.1 中的方法提取各組織的RNA 并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，然后分別取1 μL RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，以rtBgChi F 和rtBgChi R 為引物進(jìn)行BgChi 基因組織分布和時(shí)間表達(dá)檢測(cè)。擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性94℃，5 min;然后28個(gè)循環(huán)94℃，30 s，57℃，30 s，72℃，25 s。

1.2.6 熒光定量PCR 檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用TaKaRa 公司的Real Time PCR-SYBR Green 試劑在Bio-Rad 新一代CFX96 實(shí)時(shí)定量PCR 儀器上進(jìn)行，檢測(cè)BgChi 在6 齡幼蟲(chóng)期前后表達(dá)量的變化。檢測(cè)過(guò)程中以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，無(wú)菌水陰性對(duì)照。每個(gè)cDNA 樣品重復(fù)3 次。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性94℃，5 min;然后28個(gè)循環(huán)94℃，15 s，57℃，15 s，72℃，20 s。反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算目的基因的Ct值和內(nèi)參基因的Ct平均值，采用2-△Ct相對(duì)定量法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶基因的克隆與序列分析

為了獲得德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶基因，首先通過(guò)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)其它昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因的序列，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物兩對(duì)BgChi-F1，BgChi-R1 和BgChi-F2，BgChi-R2 用于擴(kuò)增BgChi 的中間片段。經(jīng)過(guò)兩輪PCR，獲得了一條約480 bp 左右的核苷酸片段(圖1 所示)，測(cè)序結(jié)果顯示該片段與禾沫蟬Poophilus costalis 幾丁質(zhì)酶的同源性為81%，可以初步確定擴(kuò)增的中間片段為幾丁質(zhì)酶基因。根據(jù)這段序列，分別在3'端和5'端設(shè)計(jì)特異性引物。利用德國(guó)小蠊5'RACE 和3'RACE cDNA 庫(kù)，分別獲得約500 bp 和1100 bp 左右的片段(圖1 所示)。經(jīng)過(guò)回收，連接，轉(zhuǎn)化，菌落PCR 驗(yàn)證和測(cè)序，結(jié)果表明獲得的目的基因?yàn)锽gChi，屬于幾丁質(zhì)酶18 家族基因。

圖1 BgChi 基因中間片段及RACE PCR擴(kuò)增的凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis analysis of BgChi part fragment and RACE amplification by PCR

通過(guò)在線分析軟件SignaIP 4.1 發(fā)現(xiàn)BgChi 蛋白N-端含有一個(gè)1-23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽;Swiss-Model 分析表明其存在一個(gè)幾丁質(zhì)酶18 家族的催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-端的幾丁質(zhì)結(jié)合域(圖2 所示);TMHMM 2.0 軟件分析BgChi 無(wú)跨膜區(qū)域，為胞外蛋白。

在線生物軟件比對(duì)，拼接中間片段，3'和5'RACE 序列，獲得德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶基因BgChi 的cDNA 全長(zhǎng)為1881 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為1620 bp，編碼539個(gè)氨基酸(圖3 所示)。預(yù)測(cè)的分子量大小為59.7 kDa，理論等電點(diǎn)為5.0。BgChi蛋白含有幾丁質(zhì)酶18 家族4個(gè)保守的氨基酸序列:保守區(qū) Ⅰ:KXXXXXGGW，保守區(qū) Ⅱ:FDGXDLDWEYP，保守區(qū) Ⅲ 和 Ⅳ 分別為:MXYDXXG 和GXXXWXXDXDD，表明其屬于典型的幾丁質(zhì)酶18 家族成員，主要與昆蟲(chóng)的蛻皮相關(guān)(圖3 所示);在終止密碼子TAA 的后面和polyA的前面發(fā)現(xiàn)了典型的加尾信號(hào)序列AATAAA 結(jié)構(gòu)，表明獲得的為完整的cDNA 序列。通過(guò)與其它物種中克隆得到的幾丁質(zhì)酶比對(duì)結(jié)果也證明了這點(diǎn)。

圖2 SMART 軟件分析BgChi 結(jié)構(gòu)域Fig.2 Domain analysis of BgChi chitinase protein by SMART software

圖3 德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶基因序列及保守氨基酸序列分析。Fig.3 The nucleotide and deduced amino acid sequences of Blattella germanica chitinase

圖4 利用MEGA 5.1 構(gòu)建的BgChi 與其它幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic analysis of BgChi and other insect chitinase genes by MEGA 5.1

2.2 BgChi 的同源性和進(jìn)化分析

將BgChi 與其它昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，這些物種及其基因氨基酸序列來(lái)自:德國(guó)小蠊Blattella germanica(KJ789158);禾沫蟬Poophilus costalis(AFW03959);蠅蛹金小蜂Nasonia vitripennis(NP_001155084);家蠶Bombyx mori(BAB13481);赤擬谷盜Tribolium castaneum(NP_001034524);岡比亞按蚊Anopheles gambiae(AAB87764);紅火蟻Solenopsis invicta(EFZ09833);野桑蠶 Bombyx mandarina(AF326596_1);埃及伊蚊Aedes aegypti(AAB81849);東方粘蟲(chóng) Mythimna separate(AAS92245);東亞飛蝗 Locusta migratoria(ABK76337);歐洲熊蜂Bombus terrestris(XP_003402985);金紋小潛細(xì)蛾P(guān)hyllonorycter ringoniella(AEP25533);二化螟 Chilo suppressalis(AAW30162);番茄夜蛾 Lacanobia oleracea(CAF05663);甜菜夜蛾 Spodoptera exigua(GU371868);亞洲玉米螟 Ostrinia furnacalis(ABI81757);斜紋夜蛾 Spodoptera litura(BAB12678);小地老虎 Agrotis ipsilon(ABW03227);甘藍(lán)夜蛾 Mamestra brassicae(ACL30984);印度跳蟻 Harpegnathos saltator(EFN88161);小菜蛾 Plutella xylostella(ACU42267);切葉蟻 Acromyrmex echinatior(EGI64271)。圖4 結(jié)果表明德國(guó)小蠊與同翅目禾沫蟬Poophilus costalis 的親緣關(guān)系最近，與膜翅目熊峰Bombus terrestris 和切葉蟻Acromyrmex echinatior 幾丁質(zhì)酶的親緣關(guān)系次之。

2.3 BgChi 在不同組織器官的表達(dá)特性

解剖6 齡3 d 德國(guó)小蠊幼蟲(chóng)組織，包括表皮、脂肪體、中腸、氣管、血細(xì)胞等，用RT-PCR 方法檢測(cè)德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶BgChi 基因的表達(dá)。由圖5 結(jié)果可知:德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶基因BgChi 在表皮、中腸和氣管均有表達(dá)，其中在表皮和氣管中的表達(dá)量較高，在中腸的表達(dá)量稍低。在脂肪體及血淋巴中未檢測(cè)到BgChi 基因的表達(dá)。說(shuō)明幾丁質(zhì)酶的表達(dá)具有組織特異性，通常在含幾丁質(zhì)的組織中表達(dá)，如昆蟲(chóng)的表皮、氣管是含有幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，中腸由于內(nèi)部有圍食膜所以也含有幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，在這幾個(gè)組織器官中，BgChi 的表達(dá)量較高。

圖5 RT-PCR 檢測(cè)德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶BgChi 基因的組織分布Fig.5 Tissue distribution of BgChi by RT-PCR in Blattella germanica

2.4 BgChi 的時(shí)間表達(dá)結(jié)果

取6 齡幼蟲(chóng)蛻皮前1-3 d 和蛻皮后1-5 d 幼蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期樣品，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用定量PCR 檢測(cè)BgChi 基因mRNA 的表達(dá)情況。如圖6 所示，德國(guó)小蠊幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量在蛻皮前達(dá)到高峰，隨著蛻皮的結(jié)束表達(dá)量隨之下降;在6 齡蛻皮幼蟲(chóng)初期表達(dá)量趨于平穩(wěn)。

圖6 德國(guó)小蠊6 齡幼蟲(chóng)蛻皮前后BgChi 表達(dá)量qTR-PCR 分析Fig.6 The relative mRNA expression of Bgchi during molting in 6th larval stage of Blattella germanica detected by qRT-PCR

3 結(jié)論與討論

幾丁質(zhì)酶是降解幾丁質(zhì)的最主要酶類之一，廣泛存在于自然界，包括細(xì)菌，真菌，病毒，昆蟲(chóng)和植物等(Arakane and Muthukrishnan，2010)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法比對(duì)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶保守序列，采用同源克隆及RACE-PCR 方法從德國(guó)小蠊中克隆得到幾丁質(zhì)酶基因。自從1993年Kramer 等首次從煙草天蛾Manduca sexta 中克隆出全長(zhǎng)的幾丁質(zhì)酶基因cDNA 序列，已有超過(guò)幾十種編碼幾丁質(zhì)酶基因的cDNA 序列從昆蟲(chóng)不同目的多個(gè)物種中被分離出來(lái)(Kcramer et al.，1993;Bolognesi et al.，2005;Genta et al.，2006;Kim et al.，2010;Zhang et al.，2012)。特別是隨著越來(lái)越多昆蟲(chóng)基因組測(cè)序工作的完成，利用生物信息學(xué)方法運(yùn)用幾丁質(zhì)酶保守結(jié)構(gòu)域獲得幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶基因序列得以實(shí)現(xiàn)。Zhu 等利用生物信息學(xué)方法比對(duì)搜索果蠅、赤擬谷盜和埃及伊蚊基因組序列，結(jié)果顯示分別有16、16 和13個(gè)幾丁質(zhì)酶或類幾丁質(zhì)酶家族基因被識(shí)別出來(lái)(2008a)，表明昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶是多基因家族。但對(duì)于非模式昆蟲(chóng)物種來(lái)講，通過(guò)構(gòu)建cDNA 文庫(kù)或利用同源克隆和RACE 擴(kuò)增的方法仍是獲得靶標(biāo)功能基因的主要手段。

本研究利用同源克隆的方法從德國(guó)小蠊中只得到了一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，但通過(guò)序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn):BgChi 含有幾丁質(zhì)酶典型的結(jié)構(gòu)域(如圖2 和圖3 所示):1個(gè)N-端的信號(hào)肽序列，1個(gè)幾丁質(zhì)催化區(qū)域，1個(gè)C-端的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域，以及連接催化區(qū)和結(jié)合區(qū)之間的連接區(qū)域。這和昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶家族Group 1 的分類特征完全一樣(Zhu et al.，2008a)。Group 1 幾丁質(zhì)酶家族主要在表皮、中腸和氣管分布，在昆蟲(chóng)蛻皮階段(幼蟲(chóng)-幼蟲(chóng)、幼蟲(chóng)-蛹、蛹-成蟲(chóng))前表達(dá)降解老的舊表皮(Daimon et al.，2005)，在這些變態(tài)階段蛻皮激素對(duì)其具有正調(diào)控作用，保幼激素起負(fù)調(diào)控作用(Zhu et al.，2008a)。氨基酸序列研究表明，BgChi 具有昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶4個(gè)保守的氨基酸序列:KXXXXXGGW，F(xiàn)DGXDLDWEYP，MXYDXXG 和GXXXWXXDXDD，是幾丁質(zhì)酶催化結(jié)構(gòu)域的重要功能區(qū)域，與幾丁質(zhì)酶的活性密切相關(guān)(Zhang et al.，2002;Zhu et al.，2004;Zhu et al.，2008b)。BgChi 幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)約含60個(gè)氨基酸，主要功能使幾丁質(zhì)酶結(jié)合不溶性的幾丁質(zhì)底物提高降解效率。用分子生物學(xué)軟件對(duì)幾丁質(zhì)酶的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析顯示，多數(shù)糖基化位點(diǎn)位于連接區(qū)域和部分催化區(qū)。除了糖基化作用之外還存在多個(gè)硫酸化和磷酸化作用位點(diǎn)，它們的修飾對(duì)蛋白功能的發(fā)揮也起到重要作用。

隨著多個(gè)昆蟲(chóng)基因組測(cè)序工作的完成和生物信息學(xué)手段的使用使我們明確昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶是多基因家族，而RNAi 技術(shù)的發(fā)展成熟則使我們能鑒定家族中的不同成員在昆蟲(chóng)發(fā)育中的具體功能。這些被識(shí)別出來(lái)的幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶成員進(jìn)一步通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)重組蛋白和通過(guò)注射幾丁質(zhì)酶家族成員的特異性dsRNA 的RNAi 實(shí)驗(yàn)得到功能上的鑒定，確認(rèn)其與幾丁質(zhì)降解有密切關(guān)系。在赤擬谷盜中，RNAi 沉默Group 1 幾丁質(zhì)酶TcChi5 導(dǎo)致注射組在成蟲(chóng)階段完全死亡，RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明正是TcChi5 轉(zhuǎn)錄本的降低所導(dǎo)致(Zhu et al.，2008c)。通過(guò)注射能夠產(chǎn)生表型的還有隸屬于其它組的幾丁質(zhì)酶成員如TcChi10，TcChi7 和IDGF4。注射TcChi10 dsRNA 不僅導(dǎo)致幼蟲(chóng)-幼蟲(chóng)期間不能完成蛻皮而死亡，而且幼蟲(chóng)-蛹、蛹-成蟲(chóng)階段也不能順利完成發(fā)育，死亡率幾乎達(dá)到100%。幾丁質(zhì)酶基因TcChi7 對(duì)赤擬谷盜腹部的形成和翅膀的發(fā)育時(shí)不可缺少的，沉默其表達(dá)導(dǎo)致出現(xiàn)腹部發(fā)育不全和翅膀畸形(Zhu et al.，2008c)。相似的研究成果在甜菜夜蛾中也得到驗(yàn)證，抑制SeChi 基因的表達(dá)會(huì)影響其幼蟲(chóng)階段的蛻皮;而抑制SeChi-h 基因的表達(dá)則會(huì)影響幼蟲(chóng)化蛹及成蟲(chóng)的羽化(Zhang et al.，2012)。說(shuō)明Group 1 幾丁質(zhì)酶基因在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要功能，通過(guò)抑制其表達(dá)則在害蟲(chóng)防治中有著良好的應(yīng)用前景。

由于昆蟲(chóng)的圍食膜和表皮主要是由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，利用幾丁質(zhì)酶來(lái)降解昆蟲(chóng)含幾丁質(zhì)的組織來(lái)抑制害蟲(chóng)的正常生理活動(dòng)，從而可以達(dá)到防治害蟲(chóng)的目的(李瑤和范曉軍，2011)。同時(shí)，高等植物和高等動(dòng)物并不含幾丁質(zhì)，因此利用幾丁質(zhì)酶防治害蟲(chóng)是一種相對(duì)安全、有效的手段，而針對(duì)幾丁質(zhì)代謝水平設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥品種，其應(yīng)用前景也必將極為廣闊。

References)

Arakane Y，Muthukrishnan S.Insect chitinase and chitinase-like proteins［J］.Cell Mol.Life Sci.，2010，67(2):201-216.

Bolognesi R，Arakane Y，Muthukrishnan S，et al，.Sequences of cDNAs and expression of genes encoding chitin synthase and chitinase in the midgut of Spodoptera frugiperda［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2005，35(11):1249-1259.

Daimon T，Katsuma S，Iwanaga M，et al.The BmChi-h gene，a bacterial-type chitinase gene of Bombyx mori，encodes a functional exochitinase that plays a role in the chitin degradation during the molting process［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2005，35(10):1112-1123.

Genta FA，Blanes L，Cristofoletti PT，et al.Purification，characterization and molecular cloning of the major chitinase from Tenebrio molitor larval midgut［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2006，36(10):789-800.

Kim JS，Je YH.A novel biopesticide production:attagel-mediated precipitation of chitinase from Beauveria bassiana SFB-205 supernatant for thermotolerance［J］.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2010，87(5):1639-1648.

Kramer KJ，Corpuz L，Choi HK，et al.Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，1993，23(6):691-701.

Kramer KJ，Muthukrishnan S.Chitin Metabolism in Insects［M］.Oxford:Elsevier Press，2005，111-134.

Li Y，F(xiàn)an J.Insect chitinase and its application in insect pest control［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2011，48(5):1489-1494.［李瑤，范曉軍.昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶及其在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用［J］.應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2011，48(5):1489-1494］

Lu HM，Meng FX，Gao CF，et al.Study on physical characteristics of Blattella germanica in different nymphal instars［J］.Chin.J.Vector Biol.＆ Control，2013，24(2):125-127.［盧慧明，孟鳳霞，高聰芬，等.德國(guó)小蠊若蟲(chóng)齡期區(qū)別的體征研究［J］.中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2013，24(2):125-127］

Merzendorfer H，Zimoch L.Chitin metabolism in insects:structure，function and regulation of chitin synthases and chitinases［J］.J.Exp.Biol.，2003，206:4393-4412.

Oliva GR，Díaz C，F(xiàn)uentes GO，et al.Blatella germanica as a possible cockroach vector of micro-organisms in a hospital［J］.Journal of Hospital Infection，2010，1:93-95.

Pan Y，Lu P，Wang Y，et al.In silico identification of novel chitinaselike proteins in the silkworm，Bombyx mori，genome［J］.J.Insect Sci.，2012，12:150.

Zhang DW，Chen J，Yao Q，et al.Functional analysis of two chitinase genes during the pupation and eclosion stages of the beet armyworm Spodoptera exigua by RNA interference［J］.Arch.Insect Biochem.Physiol.，2012，79(3-4):220-234.

Zhang F.Advances in mechanisms of insecticide resistance in Blattella germanica［J］.Chemistry of Life，2011，31(5):747-750.［張凡.德國(guó)小蠊抗藥性機(jī)理［J］.生命的化學(xué)，2011，31(5):747-750］

Zhang H，Huang X，F(xiàn)ukamizo T，et al.Site-directed mutagenesis and functional analysis of an active site tryptophan of insect chitinase［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2002，32(11):1477-1488.

Zhao ZG，Huo XB，Wang XJ，et al.Resistance of Blattella germanicato nine kinds of commonly used insecticides［J］.Chin.J.Hyg.Insect ＆ Rquip.，2012，18(1):38-40.［趙志剛，霍新北，王學(xué)軍，等.德國(guó)小蠊對(duì)9種常用殺蟲(chóng)劑的抗性測(cè)定［J］.中華衛(wèi)生殺蟲(chóng)藥械，2012，18(1):38-40］

Zhu Q，Arakane Y，Banerjee D，et al.Domain organization and phylogenetic analysis of the chitinase-like family of proteins in three species of insects［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2008a，38(4):452-466.

Zhu Q，Arakane Y，Beeman RW，et al.Characterization of recombinant chitinase-like proteins of Drosophila melanogaster and Tribolium castaneum［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2008b，38(4):467-477.

Zhu Q，Arakane Y，Beeman RW，et al.Functional specialization among insect chitinase family genes revealed by RNA interference［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2008c，105(8):6650-6655.

Zhu Q，Deng Y，Vanka P，et al.Computational identification of novel chitinase-like proteins in the Drosophila melanogaster genome［J］.Bioinformatics，2004，20(2):161-169.