陳 偉，徐衛(wèi)華

(1.廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006;2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275)

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一個多功能蛋白，它可以作為細(xì)胞骨架蛋白，與E-cadherin 形成復(fù)合體，介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附作用。此外，更為科研工作者所關(guān)注的是其在Wnt/β-catenin 信號通路中的作用(Bienz，2005)。β-catenin 是Wnt/β-catenin 信號通路的重要成員，該通路的活性取決于細(xì)胞質(zhì)中自由β-catenin 的多少，自由的β-catenin 可以由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，與T 細(xì)胞因/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)結(jié)合因子(TCF/LEF)結(jié)合而活化下游靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄(Schuijers et al.，2014)。Wnt/β-catenin 信號通路是當(dāng)前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，該通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面起著重要的生物學(xué)作用(Logan and Nusse，2004;Clevers and Nusse，2012)

棉鈴蟲Helioverpa armigera 是一種世界性的農(nóng)業(yè)害蟲，其危害的經(jīng)濟(jì)作物較多，每年給全球農(nóng)業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。棉鈴蟲以多種方式適應(yīng)外界惡劣的環(huán)境條件，滯育是其中一種重要的方式(徐衛(wèi)華，2008)。滯育是指昆蟲發(fā)育的停滯，其重要的特征是發(fā)育緩慢、代謝速率下降以及抗逆性增強(qiáng)(Denlinger，2002)。滯育并非發(fā)育的完全停止，而是另外一種特殊的發(fā)育狀態(tài)，滯育過程中部分基因的表達(dá)下降，也有部分基因的表達(dá)上升(Lu and Xu，2010;Bao and Xu，2011)。對棉鈴蟲滯育進(jìn)行研究，有較大的理論意義和應(yīng)用價值。棉鈴蟲滯育的激素調(diào)節(jié)已經(jīng)研究得比較透徹，但從分子水平闡述滯育機(jī)制的研究較少(朱佳等，2010)。鑒于Wnt/β-catenin 信號通路在發(fā)育中的重要作用，我們通過克隆β-catenin 基因并比較分析滯育和非滯育蛹腦中β-catenin 基因的表達(dá)水平變化，試圖窺探Wnt/β-catenin 信號通路是否在棉鈴蟲滯育過程中起作用。

本研究首先運(yùn)用 RACE 技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends)首次克隆了棉鈴蟲的β-catenin 基因，分析了其在滯育和發(fā)育蛹腦的差異表達(dá)情況，并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin 信號通路在棉鈴蟲發(fā)育過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲

棉鈴蟲為本課題組所飼養(yǎng)，品系由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蘇建亞教授提供，原產(chǎn)河南省。保種用的棉鈴蟲一直在25oC，14L∶10D(光照:黑暗)的條件下飼養(yǎng)。滯育型棉鈴蟲的1-3 齡幼蟲在25oC 條件下培養(yǎng)，光照條件設(shè)定為14L∶10D;生長到3 齡末期，將其轉(zhuǎn)移到20oC 恒溫培養(yǎng)箱，光照條件為10L∶14D。非滯育型棉鈴蟲的飼養(yǎng)過程與滯育型相同，差別在于其光照條件一直保持在光照14 h。

1.2 菌株、載體、細(xì)胞和試劑

大腸桿菌DH5α、昆蟲表達(dá)載體pIZ/v5-GFP、美洲棉鈴蟲Helioverpa zea 的卵巢細(xì)胞HzAm1均為本實(shí)驗(yàn)室保存;pMD18-T 載體、Taq DNA polymerase 及限制性核酸內(nèi)切酶購自Takara 公司;RACE 試劑盒購自Clontech 公司;M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega 公司;Trizol ? Reagent 購自Invitrogen 公司;質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;蛋白Marker、HRP 偶聯(lián)的羊抗兔二抗以及Western blot 所用發(fā)光液均購自Thermo 公司。其它試劑均為分析純(A.R.)。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

本研究所用的引物，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。具體序列及說明見表1。設(shè)計(jì)簡并引物時，參考已報(bào)道的棉鈴蟲近緣物種序列，如家蠶Bombyx mori，帝王蝶Danaua plexippus 和煙草天蛾Manduca sexta，找到保守的DNA 序列，以此設(shè)計(jì)簡并引物。原則是盡量選用包含簡并堿基少的序列，引物長度為16-18 堿基。

1.4 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成

按照試劑盒提供的方法，取一定量的組織，加入1 mL Trizol 進(jìn)行勻漿，提取總RNA。取1 μg RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。

1.5 RACE

按照試劑盒提供的說明，使用特定的接頭作為反轉(zhuǎn)錄引物，取1 μg RNA 為模板，分別合成5'-RACE-Ready cDNA 和3'-RACE-Ready cDNA。用基因特異性引物和試劑盒提供的UPM 引物進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增;擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后作為模板，以基因特異性引物和試劑盒提供的NUP 引物進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增后的片段與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，鑒定正確后測序分析。

1.6 序列分析

利用 DNAStar 對序列進(jìn)行分析和預(yù)測β-catenin 的ORF(開放閱讀框)。用MEGA 6.06軟件進(jìn)行遺傳距離分析，并用Maximum liklihood法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 棉鈴蟲蛹腦中β-catenin 的表達(dá)分析

取15個蛹腦，按照1.4 的方法合成第一鏈cDNA，PCR 檢測β-catenin 的表達(dá)情況，以RpL32 作為內(nèi)參對照。

1.8 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物，正向引物帶BamHI 酶切位點(diǎn)，反向引物帶XbaI 酶切位點(diǎn)，PCR 擴(kuò)增β-catenin 編碼區(qū)全長。用BamHI 和XbaI 對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切后，與同樣雙酶切的pIZ/v5-GFP 載體進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，鑒定后進(jìn)行測序確認(rèn)。

1.9 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及細(xì)胞定位研究

HzAm1 是一種半貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的Grace's 昆蟲培養(yǎng)基。在不含CO2的27℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 孔板中細(xì)胞密度約90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h 后按1∶1000 的比例加入5 mg/mL Hoechst 33342 染料，染核10 min后在倒置熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)情況，根據(jù)細(xì)胞核的位置判斷目的蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.10 Western blot 檢測

轉(zhuǎn)染48 h 后，提取蛋白，用Bradford 法測定蛋白濃度。取10 μg 蛋白上樣電泳，100 v 轉(zhuǎn)膜1 h。5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h 后分別用V5 標(biāo)簽抗體(1∶5000)和二抗(1∶3000)進(jìn)行孵育，最后進(jìn)行曝光顯影。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲β-catenin 基因的克隆與氨基酸序列分析

根據(jù)近緣物種的β-catenin 基因序列，設(shè)計(jì)了兩對簡并引物。利用巢式PCR 的方法，擴(kuò)增出了一條約700 bp 的條帶，大小與預(yù)期相符(圖1A)。對該片段測序分析，發(fā)現(xiàn)其與近緣物種的相似度較高。根據(jù)測定的序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，進(jìn)行3'-Race 和5'-Race，分別獲得了1611 bp和942 bp 的條帶(圖1B 和1C)。測序后進(jìn)行拼接，獲得了棉鈴蟲β-catenin 基因的全長cDNA 序列，命名為Har-β-catenin(Genbank 登錄號為KJ206237)。

Har-β-catenin 全長2682 bp，其中開放閱讀框2382 bp，編碼一個793 aa 的蛋白質(zhì)，預(yù)測其分子量為86.7 kDa(圖2)。已報(bào)道的β-catenin 蛋白的一個共同特征是具有多個ARM 重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Armadillo/β-Catenin-like repeats)，將預(yù)測的棉鈴蟲β-catenin 蛋白質(zhì)序列提交在線蛋白質(zhì)分析工具ExPASy(http://prosite.expasy.org/)進(jìn)行分析，結(jié)果也找到了多個ARM 重復(fù)結(jié)構(gòu)域(圖2)，這說明β-catenin 蛋白是一個在生物進(jìn)化上非常保守的蛋白質(zhì)。

圖1 Har-β-catenin 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Analysis of PCR products of Har-β-catenin by agarose gel electrophoresis

圖2 Har-β-catenin cDNA 序列及推測的氨基酸序列Fig.2 cDNA and the duduced amino acid sequences of Har-β-catenin

2.2 棉鈴蟲β-catenin 與其它昆蟲β-catenin 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

運(yùn)用MEGA 6.06 軟件對棉鈴蟲和其它已報(bào)道的部分昆蟲β-catenin 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析，結(jié)果表明棉鈴蟲首先與家蠶聚到一起，然后與帝王蝶聚為一支。該支與蠅科的果蠅和家蠅、實(shí)蠅科的地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata、蚊科的埃及伊蚊Aedes aegypti 和致倦庫蚊Culex quinquefasciatus 有較近緣的關(guān)系，最后聚為一大支(見圖3)。

2.3 Har-β-catenin 在滯育和發(fā)育蛹腦中的表達(dá)變化

選取化蛹后0、5、10 和15 d 的棉鈴蟲，利用RT-PCR 檢測Har-β-catenin 基因在棉鈴蟲滯育蛹腦和非滯育蛹腦中的差異表達(dá)情況，RpL32 基因作為內(nèi)參對照。結(jié)果表明，Har-β-catenin 在兩種發(fā)育狀態(tài)的蛹腦中均有表達(dá)。如圖4B 所示，非滯育蛹腦中Har-β-catenin 的表達(dá)量較高，且隨著發(fā)育的進(jìn)行表達(dá)量逐步上升，而滯育蛹腦中的表達(dá)較低。

圖3 Har-β-catenin 與其它昆蟲β-catenin 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences of Har-β-catenin protein

圖4 Har-β-catenin 在棉鈴蟲蛹腦中的表達(dá)變化Fig.4 Expression pattern of Har-β-catenin in brains of Helicoverpa armigera

2.4 Har-β-catenin 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位研究

為了進(jìn)一步研究棉鈴蟲β-catenin 基因的功能，構(gòu)建了Har-β-catenin 的真核表達(dá)載體。驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棉鈴蟲HzAm1 細(xì)胞，用識別載體本身表達(dá)的V5 序列的標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot發(fā)現(xiàn)，在稍小于140 kDa 處有一條特異的條帶，與預(yù)期大小一致(Har-β-catenin 86.7 kDa，載體本身表達(dá)的GFP 和V5 約35 kDa)，說明構(gòu)建的載體可以在HzAm1 細(xì)胞中正確表達(dá)。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)如圖5B 所示，Har-β-catenin 主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，預(yù)示著正常培養(yǎng)的棉鈴蟲細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號通路未被激活。

圖5 Har-β-catenin 真核表達(dá)及亞細(xì)胞定位研究Fig.5 Eukaryotic expression and subcellular localization of Har-β-catenin

3 結(jié)論與討論

β-catenin 在進(jìn)化上高度保守，它是一個多功能蛋白，通過形成不同的蛋白復(fù)合物而參與調(diào)節(jié)不同的生理功能(Damalas et al.，1999)。在細(xì)胞中，β-catenin 主要參與形成兩個重要的蛋白復(fù)合物(Kimelman and Xu，2006):①β-catenin 作為細(xì)胞骨架蛋白，通過α-catenin 在細(xì)胞膜處與E-cadherin(上皮細(xì)胞鈣粘蛋白)形成復(fù)合物(Jou et al.，1995)。該復(fù)合物介導(dǎo)同質(zhì)細(xì)胞間的粘附，在抑制腫瘤侵襲、防治細(xì)胞的移動等方面發(fā)揮重要的生理功能(王啟明等，2006)。②β-catenin同時也是Wnt/β-catenin 信號通路中的至關(guān)重要的組分，通過與TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而激活下游一系列靶標(biāo)基因，如c-myc 和cyclin D1 等的轉(zhuǎn)錄。

Wnt/β-catenin 通路的框架的建立主要是源于對果蠅的研究。1991年P(guān)eifer 等人發(fā)現(xiàn)果蠅的armadillo 基因(β-catenin 同源基因)在Wnt/β-catenin 信號通路中起調(diào)節(jié)作用(Peifer et al.，1991)。之后該通路的其它成員也逐步被鑒定出來。目前，除了在模式生物果蠅中的研究，家蠶中β-catenin 的表達(dá)及作用也有一些報(bào)道(Dhawan and Gopinathan，2004)，而其它昆蟲中β-catenin的研究很少。

本研究通過分析已知的棉鈴蟲近緣物種β-catenin 基因的序列，設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增棉鈴蟲β-catenin 基因的中間片段，然后通過RACE 技術(shù)得到了棉鈴蟲β-catenin 基因的cDNA 序列。對其推導(dǎo)的氨基酸序列提交ExPASy 網(wǎng)站進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有多個ARM 重復(fù)結(jié)構(gòu)域。ARM 重復(fù)結(jié)構(gòu)域是由約42個氨基酸組成的，一般認(rèn)為該結(jié)構(gòu)域作為分子適配器，協(xié)調(diào)β-catenin 蛋白之間的作用(Peifer，1995)。已報(bào)道的β-catenin 蛋白都含有多個串聯(lián)的ARM 重復(fù)結(jié)構(gòu)域，如人的β-catenin蛋白大小為92 kDa，含有13個ARM 重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Ilyas et al.，1997)。

克隆棉鈴蟲β-catenin 基因的cDNA 序列后，通過RT-PCR 的方法比較了滯育和非滯育蛹腦中β-catenin 基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明滯育蛹腦中β-catenin 的表達(dá)水平明顯低于非滯育蛹腦。這預(yù)示著非滯育蛹腦，也就是正常發(fā)育的棉鈴蟲蛹腦中Wnt/β-catenin 信號通路活性有可能要強(qiáng)于滯育蛹腦。換一句話說，有可能滯育蛹腦中Wnt/β-catenin 信號下調(diào)，從而使棉鈴蟲的發(fā)育受到抑制。當(dāng)然，還需要進(jìn)一步的證據(jù)才能確定該推論，因?yàn)棣?catenin 除了在Wnt/β-catenin 信號通路中起作用外，還是細(xì)胞骨架的組成成分。在后續(xù)研究中，尚需作進(jìn)一步的研究來調(diào)查棉鈴蟲滯育和非滯育蛹腦中Wnt/β-catenin 信號通路的活性，以確定該通路在棉鈴蟲滯育中的作用。

綜上所述，本研究所取得的這些階段性成果，為后續(xù)深入研究Wnt/β-catenin 信號通路在棉鈴蟲滯育中的作用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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