丁 寧 何 軼 何玉梅 王 棟 王瑞忠 魯 靜 戴 忠 馬雙成

(1.內(nèi)蒙古食品藥品檢驗(yàn)所中藥室，呼和浩特010011;2.中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所中成藥室，北京100050;3.武警總醫(yī)院中醫(yī)科，北京100039)

冠脈寧制劑由丹參、血竭、葛根、冰片等十四味中藥組成，具有活血化瘀、行氣止痛等功效，常用于以胸部刺痛、固定不移等為主癥的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)、心絞痛、冠狀動(dòng)脈供血不足等癥治療［1-4］。冠脈寧制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較多，其成分的測(cè)定項(xiàng)目也差異較大，主要有葛根素、丹酚酸B和丹參素鈉等成分的測(cè)定。葛根素為葛根的主要活性成分之一，控制葛根素可有效控制冠脈寧制劑中的葛根藥材質(zhì)量［5-7］。丹酚酸B和丹參素鈉均為丹參中的活性成分［8-9］，二者均具有清除氧自由基、促細(xì)胞增生和修復(fù)周?chē)M織等作用［10-11］。但研究［10-11］認(rèn)為丹酚酸B的清除氧自由基和誘導(dǎo)胎鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞遷移的作用較丹參素鈉強(qiáng)。在丹參藥材中丹酚酸B的量也較高［12］，因此丹酚酸B更適合用于作為丹參質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分［13］。目前中國(guó)藥典中也用丹酚酸B控制丹參藥材質(zhì)量。為了更好地控制冠脈寧片的質(zhì)量，筆者已經(jīng)分別建立了該制劑中化工染料和松香酸的檢查方法以及血竭素、11-羰基-β-乙酰乳香酸和龍腦的量的測(cè)定方法［14-16］，本文進(jìn)一步采用HPLC-DAD法對(duì)冠脈寧制劑中的葛根素和丹酚酸B同時(shí)進(jìn)行了測(cè)定，并采用該色譜條件對(duì)冠脈寧片的指紋圖譜分析方法進(jìn)行了探討，一測(cè)多評(píng)，提高檢驗(yàn)效率并節(jié)約檢驗(yàn)成本。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，2996光電二極管檢測(cè)器，Agilent 1200-6410B Triple Quad液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。

1.2 試藥

葛根素 (110752-200912)、丹酚酸 B(111562-201212)、丹參素鈉(110855-200809)、苦杏仁苷(110820-200403)、2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(110844-200908)、血竭素高氯酸鹽(110811-200704)和大黃素甲醚(110758-201114)等對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院(中國(guó)藥品生物制品檢定所)提供;甲醇(HPLC級(jí)，F(xiàn)isher公司，美國(guó))，甲酸和甲醇均為分析純(北京化工廠)，水為超純水。

1.3 樣品

冠脈寧片56批，均為市售，標(biāo)示為吉林華康藥業(yè)股份有限公司、長(zhǎng)春萬(wàn)德制藥等13家企業(yè)生產(chǎn)。

1.4 葛根素和丹酚酸B的量的測(cè)定

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)和0.5%甲酸溶液(B)梯度洗脫，0 min A為10%，30 min梯度到90%。流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)葛根素為250 nm，丹酚酸B為286 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取葛根素和丹酚酸B對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每1mL分別含葛根素0.086 88 mg和丹酚酸B 0.111 6 mg的對(duì)照品溶液。

1.4.3 供試品溶液制備

取本品20片(粒)，研細(xì)，取0.2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL錐形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

1.4.4 陰性樣品溶液制備

按處方比例分別制備不含葛根和丹參的冠脈寧制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

1.5 指紋圖譜研究

1.5.1 色譜條件

同1.4.1，檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.5.2 對(duì)照品溶液制備

取葛根素、丹酚酸 B、丹參素鈉、苦杏仁苷、2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷、血竭素高氯酸鹽、大黃素甲醚等對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每1 mL分別含0.1 mg的對(duì)照品溶液。

1.5.3 供試品溶液制備

同1.4.3。

2 結(jié)果

2.1 葛根素和丹酚酸B的量的測(cè)定

2.1.1 系統(tǒng)適用性及專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液10 μL，在上述色譜條件下分析，色譜圖見(jiàn)圖1-3。葛根素和丹酚酸B的保留時(shí)間分別為13.4 min和19.4 min，計(jì)算理論板數(shù)分別為73 992和115 457，并且與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.5。葛根與丹參陰性樣品溶液色譜圖中，在與葛根素及丹酚酸B對(duì)照品相應(yīng)位置上均有一個(gè)較小的色譜峰，但其峰面積小于正常樣品的2%，對(duì)樣品測(cè)定影響較小。

2.1.2 定量限

將對(duì)照品溶液稀釋?zhuān)M(jìn)行色譜分析，以信噪比法測(cè)定葛根素和丹酚酸B定量限分別為0.20 μg/mL和0.20 μg/mL。

2.1.3 線性關(guān)系考察

精密吸取葛根素和丹酚酸B對(duì)照品溶液適量，加70%甲醇稀釋成每1 mL各含葛根素0.002 523～0.504 6 mg，含丹酚酸B 0.002 657～0.425 2 mg的混合對(duì)照品溶液。分別吸取10 μL，在上述色譜條件下分析，記錄峰面積。以色譜峰面積(y)對(duì)對(duì)照品濃度(x)進(jìn)行回歸，計(jì)算回歸方程。葛根素回歸方程為y=2.269 2×107x+28 988，r=0.999 9;丹酚酸B 回歸方程為 y=6.441 3×106x-110，r=0.999 9。說(shuō)明葛根素在0.005 046～0.504 6 mg/mL范圍內(nèi)，丹酚酸 B在0.002 657～0.425 2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(通化永倉(cāng)藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130101)6份，按照1.4.3供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依1.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果葛根素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.28 mg/g，RSD為1.4%，丹酚酸B平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.5 mg/g，RSD為1.5%，表明該實(shí)驗(yàn)有良好的重現(xiàn)性。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知濃度的樣品(通化永倉(cāng)藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130101)約10 g共6份，分別加入一定量的葛根素和丹酚酸B混合對(duì)照品溶液，按照供試品溶液制備方法制備，計(jì)算回收率。葛根素平均加樣回收率為99.53%，RSD值為1.5%，丹酚酸B的平均加樣回收率為102.2%，RSD值為1.4%，結(jié)果見(jiàn)表1，2。

圖1 冠脈寧制劑葛根素和丹酚酸B混合對(duì)照品溶液Fig.1 HPLC chromatograms of the mixture reference solution of puerarin and salvianolic acid B

圖2 供試品溶液Fig.2 Sample solution

圖3 葛根陰性樣品溶液和丹參陰性樣品溶液Fig.3 Blank sample of Puerariae Lobatae Radix and blank sample of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma

表1 葛根素加樣回收率實(shí)驗(yàn)Tab.1 Recovery results of puerarin

表2 丹酚酸B加樣回收率實(shí)驗(yàn)Tab.2 Recovery results of salvianolic acid B

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取同一供試品(通化永倉(cāng)藥業(yè)有限公司，批號(hào):20130101)，分別于 0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 測(cè)定，測(cè)得葛根素和丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.4%和1.2%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 樣品測(cè)定

對(duì)13個(gè)廠家56批次的樣品進(jìn)行測(cè)定，不同樣品中葛根素的量為0.37～8.10 mg/片，丹酚酸B的量為0.08 ～4.10 mg/片，差異較大。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品(通化永倉(cāng)藥業(yè)有限公司，批號(hào):20130101)按1.5.3項(xiàng)下供試品溶液方法制備供試品溶液，平行制備6份。分別依據(jù)1.5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2.0版)計(jì)算所得色譜圖之間相似度均大于0.94。

2.2.2 穩(wěn)定性

取同一供試品溶液(通化永倉(cāng)藥業(yè)有限公司，批號(hào):20130101)，按照1.5.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2.0版)計(jì)算所得色譜圖之間相似度均大于0.92。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 指紋圖譜中色譜峰的指認(rèn)

為進(jìn)一步對(duì)指紋圖譜中的色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，本試驗(yàn)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)樣品進(jìn)行了測(cè)定。

色譜條件同1.5.1項(xiàng)下。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù):ESI+掃描，毛細(xì)管電壓:4 kV，干燥氣:氮?dú)?，干燥氣溫?300℃，干燥氣流速10 L·min-1，掃描范圍:110～1 000 m/z。葛根素和丹酚酸B由于濃度較高，干擾較小，使用一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行定性，其余化合物濃度偏小，采用二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行定性。可在樣品色譜圖中歸屬丹參素鈉、苦杏仁苷、葛根素、2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、丹酚酸B、血竭素高氯酸鹽、大黃素甲醚等化合物，分別來(lái)源于丹參、桃仁、葛根、何首烏、血竭等藥材(圖4)。各化合物保留時(shí)間及質(zhì)譜裂解電壓和碰撞能見(jiàn)表3。

圖4 在冠脈寧片樣品色譜圖中指認(rèn)的化合物Fig.4 The assigned compounds in the chromatography of Guanmaining tablet

表3 各化合物保留時(shí)間及質(zhì)譜裂解電壓和碰撞能Tab.3 The retention time，fragment or voltage and collision energy of chemical compounds

2.2.4 樣品測(cè)定

采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的指紋圖譜2.0版軟件進(jìn)行分析。將所得到的56批樣品的色譜圖進(jìn)行全譜匹配，其相似度計(jì)算結(jié)果為0.25～0.98。多數(shù)批次樣品的指紋圖譜相似度均大于0.8，有22個(gè)批次的樣品其相似度低于0.8，占樣品總數(shù)的34.4%。

3 討論

在建立方法時(shí)，考察了超聲提取15、20和30 min對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。超聲20 min后，葛根素和丹酚酸B的量沒(méi)有變化。故最終確定采用超聲提取20 min的提取條件。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)56批次冠脈寧片進(jìn)行了測(cè)定。不同樣品中丹酚酸B的量為0.08～4.10 mg/片，差異較大?？赡苁歉鲝S家提取工藝不同，丹酚酸B穩(wěn)定性差，在水煮過(guò)程中易損失。

從樣品中葛根素的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，葛根素量偏低的樣品主要集中于一個(gè)生產(chǎn)廠家，該廠產(chǎn)品執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有量的測(cè)定項(xiàng)。此外，將本文所建立方法的測(cè)定結(jié)果與使用原藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)的結(jié)果比較，所建立方法的量的測(cè)定結(jié)果除一個(gè)批次外均高于原標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果。分析原因可能與提取條件不同有關(guān)。鑒于冠脈寧制劑藥品標(biāo)準(zhǔn)眾多，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的提取條件、色譜條件以及制定的限度也不盡相同。因此有必要考慮統(tǒng)一冠脈寧片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以進(jìn)一步控制冠脈寧片的質(zhì)量。

指紋圖譜相似度測(cè)定結(jié)果與生產(chǎn)廠家有一定的相關(guān)性(Pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)0.474，P＜0.01)，可能在提取過(guò)程中不同廠家還存在工藝的差別。因此有必要對(duì)冠脈寧制劑的生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究，規(guī)范生產(chǎn)工藝，保證冠脈寧制劑的有效性和安全性。

冠脈寧片中葛根素和(或)丹酚酸B的量的測(cè)定方法已有文獻(xiàn)［17-20］報(bào)道。本文在進(jìn)行量的測(cè)定的同時(shí)，利用所得到的圖譜，對(duì)該制劑的指紋圖譜進(jìn)行了探討，一測(cè)多評(píng)，有利于節(jié)約檢測(cè)成本，提高效率。此外文獻(xiàn)中使用的色譜條件為乙腈-甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫，本文改用可揮發(fā)的甲酸作為流動(dòng)相，便于在指紋圖譜研究時(shí)借助液相質(zhì)譜聯(lián)用確認(rèn)色譜峰，提高指紋圖譜的針對(duì)性。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十冊(cè)［S］.1995:122.

［2］ 陳興華.冠脈寧片合黃芪注射液治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛52例療效觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2010，19(7):1095-1096.

［3］ 楊天侖，林少平，李新中，等.冠脈寧治療50例冠心病、心絞痛、心血瘀阻證的療效觀察［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，1999，9(3):14-15.

［4］ 劉萬(wàn)利.冠脈寧片治療心血瘀阻型胸痹療效觀察［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(18):95-96.

［5］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:312.

［6］ 秦健，王珂雅，吳孟嵐.HPLC測(cè)定冠脈寧片中葛根素的含量［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2007，8(3):40-42.

［7］ 鄭巍.高效液相色譜法測(cè)定冠脈寧片中葛根素含量［J］.山西中醫(yī)，2010，26(5):50-51.

［8］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010版一部［J］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:70.

［9］ 倪力軍，賀靜，張立國(guó)，等.丹酚酸提取物的HPLC圖譜與其抗氧化活性關(guān)系研究［J］.中成藥，2011，33(12):2029-2033.

［10］劉梅，夏鑫華，張志敏，等.丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和丹酚酸B體外抗氧化活性比較研究［J］.中藥材，2009，32(2):265-267.

［11］郭國(guó)慶，沈偉哉，鐘世鎮(zhèn).丹參素和丹酚酸對(duì)胎鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(7):1225-1229.

［12］游勇基，陳銘輝.高效液相色譜法測(cè)定丹參中丹酚酸B等3種有效成分［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38(12):950-952.

［13］王敏，王逢春，郭琪.丹參藥材脂溶性有效成分的快速指紋圖譜研究［J］.解放軍醫(yī)藥雜志，2013，25(11):78-80.

［14］何軼，丁寧，王瑞忠，等.冠脈寧片中化工染料檢查及血竭素高氯酸鹽含量測(cè)定研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2015，50(2):120-124.

［15］丁寧，王棟，何軼，等.冠脈寧片中樟腦的限量檢查及冰片的含量測(cè)定研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2015，50(4):310-313.

［16］王瑞忠，張玉榮，何軼，等.HPLC法測(cè)定冠脈寧片(膠囊)中 11-羰基-β-乙酰乳香酸及松香酸檢查［J］.中成藥，2014，36(11):2326-2330.

［17］程夏倩，張文婷，程維明，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定冠脈寧片中葛根素和丹酚酸 B［J］.中成藥，2012，34(12):2355-2358.

［18］柏冬，李強(qiáng)，周玥，等.HPLC測(cè)定冠脈寧膠囊中丹酚酸B含量［J］.中成藥，2007，29(8):附23-附24.

［19］張雪慧.HPLC法測(cè)定冠脈寧顆粒中丹參素鈉的含量［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2008，28(1):60-61.

［20］紀(jì)紅，朱志杰，劉長(zhǎng)華，等.高效液相色譜法測(cè)定冠脈寧片中丹酚酸B含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18(6):38.