周麗紅 賀昕紅 龍 燕 藺 莉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京100050)

宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌。經(jīng)過(guò)幾十年廣泛開(kāi)展婦科普查，宮頸癌的發(fā)病率及病死率降低了近68%，但仍居我國(guó)婦女惡性生殖道腫瘤第一位，且發(fā)病正呈現(xiàn)一種年輕化趨勢(shì)［1-2］。目前認(rèn)為高危型人乳頭瘤病毒(high risk-human papillomavirus，HR-HPV)感染是首要病因［3-4］。近年的研究［5-7］表明，宮頸細(xì)胞由瘤樣病變向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變的過(guò)程中幾乎都伴有3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增，涉及到的最重要的基因是人端粒酶RNA基因(human telomerase RNA component，HTERC)。應(yīng)用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridizatiom，F(xiàn)ISH)技術(shù)進(jìn)行3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)從正常宮頸、宮頸炎(chronic cervicitis，CC)、宮頸細(xì)胞內(nèi)瘤變到宮頸癌，HPV和端粒酶的協(xié)同表達(dá)及表達(dá)強(qiáng)度依次增加［3］。有研究［7］顯示對(duì)宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)患者隨訪發(fā)現(xiàn)，CINⅠ病變消退者HTERC基因的表達(dá)量與正常患者無(wú)差異。由于CIN治療后有5% ～10%的殘留和復(fù)發(fā)率［4］，治療后的長(zhǎng)期隨訪非常重要。不同程度宮頸病變治療后應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)HTERC基因在隨訪中的應(yīng)用價(jià)值如何，相關(guān)報(bào)道較少。本研究在前期研究基礎(chǔ)上旨在對(duì)不同級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變的患者行治療后進(jìn)行1年隨訪，應(yīng)用FISH技術(shù)和原位雜交捕獲法檢測(cè)宮頸HTERC基因表達(dá)，希望發(fā)現(xiàn)術(shù)后HTERC陰性者宮頸病變無(wú)復(fù)發(fā)或者殘留病變會(huì)消退，而HTERC陽(yáng)性者宮頸病變有復(fù)發(fā)或者殘留病變會(huì)進(jìn)行性發(fā)展，進(jìn)一步探討HTERC基因檢測(cè)在宮頸CIN治療后的病情檢測(cè)中的價(jià)值，希望發(fā)現(xiàn)宮頸癌的易感人群并進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)、及時(shí)治療，降低宮頸癌的發(fā)病率。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院婦產(chǎn)科2012年2月至2012年10月陰道鏡下宮頸活檢病理診斷結(jié)果為CIN及原位癌的患者作為研究對(duì)象，共有83例病例非隨機(jī)連續(xù)入組?；颊咧委熐昂缶袑m頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查、高危型人乳頭瘤病毒檢測(cè)及HTERC基因檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 HTERC檢測(cè)標(biāo)本收集

使用宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查(thin prep cytologic test，TCT)細(xì)胞釆集刷插入宮頸外口鱗柱狀上皮交界處，并以子宮頸外口為中心，均勻旋轉(zhuǎn)5～7周，取出宮頸刷后，刷頭放入TCT細(xì)胞保存液內(nèi)搖勻，使采集細(xì)胞溶于保存液內(nèi)，注明檢查者姓名、年齡、取材日期，采用FISH方法檢測(cè)。

1.2.2 FISH技術(shù)檢測(cè)HTERC基因方法

取5～10 mL采集的細(xì)胞樣本，經(jīng)多次離心，膠原酶B、胃蛋白酶消化，梯度脫水后制片進(jìn)行FISH操作:將玻片清洗梯度脫水變性，避光環(huán)境中配置探針混合液滴于雜交區(qū)域，雜交過(guò)夜。第二天玻片洗脫，自然干燥玻片，DAPI復(fù)染，加蓋玻片，暗處放置20 min后進(jìn)行顯微鏡下FISH信號(hào)觀察。在暗室內(nèi)，使用日本 Olympus BX51型熒光顯微鏡，DAPI/FIFC/Texas Red三色濾光鏡激發(fā)觀察間期細(xì)胞熒光雜交信號(hào)，并用俄羅斯Video-Test公司提供的FISH分析軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.3 FISH信號(hào)判斷

正常細(xì)胞單個(gè)間期細(xì)胞核中紅色及綠色信號(hào)各為2個(gè)，如圖1。HTERC基因擴(kuò)增異常細(xì)胞單個(gè)間期細(xì)胞核中紅色信號(hào)大于2個(gè)，綠色信號(hào)不少于2個(gè)，如圖2。在熒光顯微鏡下觀察FISH信號(hào):每例分析200個(gè)間期細(xì)胞核，對(duì)各通道下均顯示清晰可辨的、孤立的、雜交信號(hào)明顯的細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算其所占百分比。對(duì)重疊、破損、輪廓不清的信號(hào)不計(jì)數(shù)，雜交信號(hào)微弱者不計(jì)數(shù)。細(xì)胞內(nèi)雜交信號(hào)互相靠近者計(jì)為1個(gè)信號(hào)。以20個(gè)正常宮頸FISH結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，以3個(gè)及以上紅色信號(hào)的間期細(xì)胞比例＞9.23%者為HTERC基因擴(kuò)增陽(yáng)性患者;≤9.23%者為陰性患者。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。等級(jí)資料用例數(shù)表示，治療前、后比較采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05。

圖1 HTERC擴(kuò)增陰性細(xì)胞Fig.1 Cell with negative HTERC

2 結(jié)果

2.1 治療前情況

圖2 HTERC擴(kuò)增陽(yáng)性細(xì)胞Fig.2 Cell with positive HTERC

治療前各級(jí)CIN中HR-HPV及HTERC檢測(cè)情況詳見(jiàn)表1，隨CIN分級(jí)增加，HTERC擴(kuò)增陽(yáng)性率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.97，P=0.000)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，CINⅠ與CINⅡ之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CINⅠ、CINⅡ分別與CINⅢ之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;隨CIN分級(jí)增加，高危型HPV感染陽(yáng)性率有增加趨勢(shì)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.347，P=0.061)。HTERC陽(yáng)性表達(dá)患者均合并HR-HPV感染。

表1 各級(jí)CIN中HTERC擴(kuò)增及高危型HPV感染情況Tab.1 All levels of HTERC amplification and high-risk type HPV infection in CIN n(%)

2.2 治療后隨訪情況

全部83例患者中僅2例宮頸錐切術(shù)患者、手術(shù)病理為宮頸浸潤(rùn)癌Ia1，于宮頸錐切治療后1～2個(gè)月行全子宮切除術(shù)，另1例宮頸錐切病理顯示為CINⅢ(原位癌)，患者要求行全子宮切除術(shù)，該3例全子宮切除術(shù)患者治療后復(fù)查病理未見(jiàn)異常。治療后半年隨訪成功76例，失訪7例，該76例患者治療后1年成功隨訪。失訪7例患者治療前CIN分級(jí)分別為CINⅠ1例(HR-HPV陽(yáng)性、HTERC陰性)、CINⅡ 2例(均HR-HPV陽(yáng)性、HTERC陰性)、CINⅢ 4例(3例均HR-HPV陽(yáng)性、HTERC陽(yáng)性，1例HR-HPV陽(yáng)性，HTERC陰性)，失訪原因?yàn)?例患者妊娠狀態(tài)，3例患者因異地拒絕來(lái)院隨訪。

2.2.1 各級(jí)宮頸病變治療后轉(zhuǎn)歸情況

治療后半年及1年宮頸病變轉(zhuǎn)歸情況詳見(jiàn)表2。治療后半年宮頸病變與治療前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.680，P=0.000)。治療后1年宮頸病變與治療前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.689，P=0.000)。

2.2.2 宮頸脫落細(xì)胞學(xué)轉(zhuǎn)歸與宮頸病變關(guān)系

治療后復(fù)查宮頸脫落細(xì)胞學(xué)情況詳見(jiàn)表3，治療前宮頸脫落細(xì)胞檢查結(jié)果為無(wú)上皮內(nèi)病或惡性病變(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM)9 人、非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cell of undetermined significance，ASC)31人、低度鱗狀細(xì)胞病變(lower-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)24 人、高度鱗狀細(xì)胞病變(higher-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)12人，治療后半年宮頸脫落細(xì)胞學(xué)情況與治療前比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.287，P=0.000)，治療后1年宮頸脫落細(xì)胞學(xué)情況與治療前比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.259，P=0.000)。

表2 治療后各級(jí)宮頸病變轉(zhuǎn)歸情況Tab.2 The outcome of all levels of CIN after treatment

表3 治療后宮頸脫落細(xì)胞學(xué)轉(zhuǎn)歸與宮頸病變關(guān)系Tab.3 The relation of cervical exfoliated cytology outcome with cervical lesions after the treatment

2.2.3 治療后HR-HPV轉(zhuǎn)歸與宮頸病變關(guān)系

治療后復(fù)查HR-HPV情況詳見(jiàn)表4，治療前HRHPV陽(yáng)性患者約72人、陰性約4人，治療后半年復(fù)查情況與治療前比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.557，P=0.000)，治療后1半年復(fù)查情況與治療前比較，認(rèn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.416，P=0.000)。

表4 治療后HR-HPV轉(zhuǎn)歸與宮頸病變情況Tab.4 Relation of HR-HPV with cervical lesions after the treatment

2.2.4 治療后HTERC轉(zhuǎn)歸與宮頸病變關(guān)系

76例隨訪成功患者，治療后半年及1年復(fù)查HTERC均為陰性(治療后半年CC 64例、CINⅠ 10例、CINⅡ1例、CINⅢ 1例，治療后1年CC 73例、CINⅠ3例)，治療后半年及1年與治療前比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.745，P=0.000)。

2.2.5 HTERC陽(yáng)性和HTERC陰性的宮頸病變患者治療后轉(zhuǎn)歸情況

1)HTERC陽(yáng)性的宮頸病變患者治療后轉(zhuǎn)歸情況:治療前共36例HTERC陽(yáng)性的宮頸病變患者、其中CINⅠ 4例，CINⅡ 7例，CINⅢ 25例(脫訪3例)，治療后宮頸病變轉(zhuǎn)歸情況詳見(jiàn)表5。治療后半年宮頸病變轉(zhuǎn)歸情況與治療前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.045，P=0.000)。治療后1年宮頸病變與治療前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.184，P=0.000)。

表5 HTERC(+)治療后半年及1年宮頸病變轉(zhuǎn)歸情況Tab.5 Relation of HTERC(+)with cervical lesions after the treatment

2)HTERC陰性的宮頸病變患者治療后轉(zhuǎn)歸情況:治療前HTERC陰性患者共47例，其中CINⅠ38例(失訪1例)、CINⅡ3例(失訪2例)、CINⅢ 6例(失訪1例)，治療后復(fù)查情況見(jiàn)表6。治療后半年宮頸病變轉(zhuǎn)歸情況與治療前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.308，P=0.000)。治療后1年宮頸病變與治療前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.209，P=0.000)。

表6 HTERC(-)治療后半年及1年宮頸病變轉(zhuǎn)歸情況Tab.6 The relation of HTERC(-)with cervical lesions after the treatment

3 討論

目前宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的常規(guī)篩查手段主要有宮頸脫落細(xì)胞學(xué)及HPV檢測(cè)，宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)易出現(xiàn)假陰性［6，8］。高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)病的首要因素，絕大部分女性一生中都存在HPV的感染，但僅極少數(shù)發(fā)展成宮頸癌。潘虹等［4］對(duì)700例患者進(jìn)行HPV-DNA檢測(cè)及液基細(xì)胞學(xué)檢查，結(jié)果顯示，ASCUS、LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細(xì)胞癌的HPV陽(yáng)性率分別為67%、93.3%、100%、100%，而正常宮頸HPV陽(yáng)性率為43.6%。HPV檢測(cè)對(duì)于宮頸癌篩查特異性差，且大部分HPV感染往往能自行消退，故單純HPV檢測(cè)有增加宮頸病變過(guò)度治療可能［9］。宮頸脫落細(xì)胞學(xué)或HPV檢測(cè)不能從基因角度篩查宮頸病變，更無(wú)法從基因角度預(yù)測(cè)篩查出的CIN哪些將會(huì)進(jìn)展為宮頸癌。當(dāng)今宮頸癌篩查及預(yù)后監(jiān)測(cè)越來(lái)越引起人們的關(guān)注，如何尋找一種靈敏度、特異度好又衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)的篩查預(yù)后評(píng)估方案成了國(guó)內(nèi)外學(xué)者奮斗的目標(biāo)。

近年研究［7，10-13］表明宮頸細(xì)胞由非典型病變向癌轉(zhuǎn)變的過(guò)程中幾乎都伴有3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增，其中涉及到的最重要的基因可能是HTERC基因。HTERC定位在3q23.3，約450 bp，其序列中有一長(zhǎng)度為11個(gè)核苷酸(5'-CUAACCCUAAC-3')片段，與人類端粒的重復(fù)序列(TTAGGG)互補(bǔ)，視為合成端粒重復(fù)序列的模板。Hopman等［14］發(fā)現(xiàn)HTERC編碼的端粒酶核糖核酸為端粒酶的重要組成成分，端粒酶活性主要在腫瘤組織中表達(dá)，正常組織它通過(guò)直接合成六聚體三核苷酸末端N進(jìn)入染色體3'端，并以內(nèi)部RNA作為模板形成末端結(jié)構(gòu)特異的染色體DNA，即端粒，從而介導(dǎo)細(xì)胞的老化和腫瘤的形成。FISH主要是利用DNA序列的互補(bǔ)性，通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針與預(yù)處理的待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，即可對(duì)細(xì)胞中的染色體或基因異常進(jìn)行檢測(cè)和診斷，而檢測(cè)的標(biāo)本可以是中期分裂象也可以是間期細(xì)胞。由于技術(shù)本身操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、具有較高的靈敏度及特異度等幾大優(yōu)點(diǎn)，因此很適合臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)，但存在費(fèi)用較高的問(wèn)題。

通過(guò) FISH 檢測(cè)，多項(xiàng)研究［12，14-16］顯示 HTERC 基因在各級(jí)宮頸病變中均有一定程度的表達(dá)，HTERC基因的陽(yáng)性率隨宮頸病變的分級(jí)而有上升趨勢(shì)，且HTERC基因在高度病變中的陽(yáng)性率明顯高于低度病變，HTERC有望成為宮頸癌前病變?cè)缙谠\斷的生物學(xué)分子，本研究的治療前實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述國(guó)內(nèi)外的研究一致。

Heselmeyer-Haddad等［17］發(fā)現(xiàn) HTERC 基因表達(dá)水平與宮頸癌的分級(jí)、分期及淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并回顧性的對(duì)1至3年前婦女的液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行HTERC基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HTERC擴(kuò)增陽(yáng)性的患者，無(wú)論正常宮頸組織及還是CINⅠ及CINⅡ，均進(jìn)展為CINⅢ或?qū)m頸癌，HTERC擴(kuò)增陰性的CINⅢ則消退為正常宮頸。說(shuō)明HTERC與宮頸病變進(jìn)展有關(guān)，并可能在其中發(fā)揮重要作用。Alaneda等［18］研究中對(duì)30例CINⅠ患者進(jìn)行2年長(zhǎng)期隨訪，發(fā)現(xiàn)CINⅠ病變消退者HTERC基因的表達(dá)量與正?；颊邿o(wú)差異，且顯著低于持續(xù)存在或進(jìn)展的CINⅠ。但該研究?jī)H對(duì)CINⅠ患者進(jìn)行隨訪觀察，未行宮頸治療。由于CIN治療后有一定的殘留和復(fù)發(fā)率，治療后的長(zhǎng)期隨訪非常重要。宮頸病變不同程度(CINⅠ～Ⅲ和原位癌)治療后應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)HTERC基因在隨訪中的應(yīng)用價(jià)值如何，相關(guān)報(bào)道較少，有學(xué)者［19-21］對(duì)CINⅠ/CINⅡ行宮頸環(huán)形電切術(shù)(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)治療后隨訪6個(gè)月，結(jié)果顯示治療后FISH檢測(cè)HTERC基因陽(yáng)性表達(dá)率較治療前的明顯降低，但HTERC基因表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性患者治療后病變殘留率較HTERC基因表達(dá)陰性、弱陽(yáng)性及中等陽(yáng)性患者升高。本研究治療后半年宮頸病變異常程度、宮頸脫落細(xì)胞學(xué)異常情況、高危型HPV陽(yáng)性率及HTERC基因檢測(cè)陽(yáng)性率均較治療前明顯減少、僅存在2例宮頸病變，可見(jiàn)手術(shù)治療能有效的降低宮頸病變的程度及使宮頸病變消退，降低宮頸細(xì)胞學(xué)異常程度、高危型HPV陽(yáng)性率及HTERC基因的陽(yáng)性率。本研究資料顯示HTERC基因表達(dá)陽(yáng)性患者治療后病變殘留率與HTERC基因表達(dá)陰性患者無(wú)差異，與上述文獻(xiàn)相異可能與本院治療效果及樣本量相關(guān);治療后半年HTERC基因均為陰性，76例患者中僅存在12例宮頸病變(10例CINⅠ、1例CINⅡ、1例CINⅢ)，治療后1年復(fù)查有9例CINⅠ病變均消失，1例持續(xù)為CINⅠ，1例CINⅡ減輕為CINⅠ，1例CINⅢ在行全子宮切除術(shù)后復(fù)查病理正常，此外1例慢性炎(合并高危型HPV感染)在治療后1年病理進(jìn)展為CINⅠ(持續(xù)合并高危型HPV感染)。表明治療后半年HTERC陰性的CINⅠ患者在治療后1年內(nèi)病變消退可能性大，HTERC基因檢測(cè)能較好預(yù)測(cè)治療后宮頸病變進(jìn)一步發(fā)展情況，但因樣本及時(shí)間有限，需進(jìn)一步觀察。臨床中，因HTERC檢測(cè)費(fèi)用較高，暫不適宜用于篩查宮頸癌及宮頸病變，在患者有HR-HPV持續(xù)感染、特別是宮頸出現(xiàn)CIN改變時(shí)，可行HTERC基因檢測(cè)輔助預(yù)測(cè)病變的發(fā)展情況。

Chen等［22］用FISH技術(shù)檢測(cè)671人的宮頸細(xì)胞中HTERC基因的擴(kuò)增情況，發(fā)現(xiàn)HTERC陽(yáng)性的靈敏度及特異度分別為90%和89.6%，HPV陽(yáng)性的靈敏度及特異度分別為100%和44%。可見(jiàn)HTERC陽(yáng)性擴(kuò)增率具有較高的特異度，HPV具有較高的靈敏度。本研究發(fā)現(xiàn)治療復(fù)查，宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)于宮頸病變預(yù)測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值相對(duì)較強(qiáng)，治療后半年和1年分別為50%(3/6)和100%(2/2)，HR-HPV檢查對(duì)于宮頸病變預(yù)測(cè)的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值相對(duì)較高，治療后半年和1年靈敏度分別為83.3%(10/12)和66.7%(2/3)，治療后半年和1年陰性預(yù)測(cè)值分別為95.7%(45/47)和98.3%(58/59)，HTERC檢測(cè)對(duì)于宮頸病變預(yù)測(cè)特異度最高，分別為100%(64/64)和100%(73/73)。HTERC基因檢測(cè)的特異度最好，高危型HPV的靈敏度及陰性預(yù)測(cè)值較好，宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較高。本研究治療后HTERC基因檢測(cè)均為陰性，可能與研究對(duì)象均為手術(shù)治療后的患者及樣本數(shù)量小相關(guān)，需擴(kuò)大樣本量及延長(zhǎng)隨訪時(shí)間。

綜上所述，隨宮頸病變程度增加，HTERC基因檢測(cè)陽(yáng)性率增加且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;手術(shù)治療能有效降低宮頸病變程度、高危型HPV陽(yáng)性率及HTERC基因的陽(yáng)性表達(dá)率［23］;在患者有HR-HPV持續(xù)感染、特別是宮頸出現(xiàn)CIN改變時(shí)，可行HTERC基因檢測(cè)輔助預(yù)測(cè)病變的發(fā)展情況;本研究發(fā)現(xiàn)，患者治療后在上述幾項(xiàng)監(jiān)測(cè)方法中，HTERC基因檢測(cè)的特異度最好，高危型HPV的靈敏度及陰性預(yù)測(cè)值較好，宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較高。

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