任 宇 侯曉樸 李 丹 李 穎 朱 斌*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院普通外科，北京大學(xué)第九臨床醫(yī)學(xué)院，北京100038;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院乳腺外科，北京100006;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院介入科，北京100015)

7，12-二甲基苯并蒽(7，12-dimethylbenzanthracene，DMBA)等致癌物質(zhì)作用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可引起腫瘤的發(fā)生。文獻(xiàn)［1-3］報(bào)道DMBA誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰腺癌所用的劑量與時(shí)間各不相同，一般說來劑量大，成模時(shí)間短，動(dòng)物病死率高;劑量小則成模時(shí)間長，但動(dòng)物病死率低。該模型的不足之處是采用手術(shù)方法進(jìn)行造模，對(duì)操作者技能要求較高，成瘤率不夠穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)擬將小劑量DMBA(2 mg/100 g)置入SD(Sprague-Dawley)大鼠胰腺，定期稱量大鼠體質(zhì)量及行胰腺病理學(xué)觀察，研究DMBA對(duì)大鼠胰腺的影響，探討小劑量DMBA誘導(dǎo)大鼠胰腺腫瘤動(dòng)物模型的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

SD大鼠，雄性，5周齡，體質(zhì)量為180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001;DMBA(Sigma公司，美國);10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛溶液;10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲醛溶液;石蠟包埋機(jī)，切片機(jī)(Leica公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

選擇70只SD大鼠，應(yīng)用數(shù)字表法將大鼠進(jìn)行完全隨機(jī)化分組，根據(jù)術(shù)中是否置入藥物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，單籠喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組(共60只):手術(shù)切開大鼠胰腺被膜，按2 mg/100 g劑量置入DMBA;對(duì)照組(共10只):僅行胰腺被膜的切開，不置入任何藥物。兩組大鼠術(shù)后每月稱量體質(zhì)量，分別于術(shù)后2、4、6個(gè)月處死取材，并行胰腺病理學(xué)檢查。

1.2.2 模型制作

SD大鼠術(shù)前24 h電子秤稱量體質(zhì)量后禁食，不禁水，選用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛溶液(3 mL/kg)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)板，用紗布醮取0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液濕潤腹部被毛并剔除干凈，碘伏消毒。

每只大鼠均經(jīng)上腹正中偏左約0.5 cm處作一縱行切口，長約2 cm，手術(shù)刀切開皮膚，剪刀剪開腹壁肌肉進(jìn)入腹腔，用棉簽醮取0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液后翻轉(zhuǎn)胃體及脾臟，將胰腺充分暴露，濕紗布保護(hù)其他器官。實(shí)驗(yàn)組大鼠用顯微鑷輕輕提起胰腺體尾部，于胰腺最厚處剪開被膜及部分胰腺實(shí)質(zhì)，深入胰腺實(shí)質(zhì)約2 mm，通過自制加藥匙按2 mg/100 g劑量置入DMBA，用6-0 Prolene縫合線縫合胰腺被膜，打結(jié)，距線結(jié)0.3 cm處剪斷縫合線，便于后期尋找藥物包埋位置。對(duì)照組大鼠僅作開關(guān)腹及剪開胰腺被膜，胰腺內(nèi)不置入任何藥物。用濕棉簽復(fù)位腹腔各器官，3-0縫線連續(xù)縫合腹壁肌肉及皮膚。術(shù)后大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于普通級(jí)環(huán)境，飲食同術(shù)前。整個(gè)手術(shù)過程細(xì)致輕柔，注意不損傷其他組織、器官，肉眼觀察無DMBA晶體散落于腹腔。建模方法見參考文獻(xiàn)［3-4］。

1.2.3 病理學(xué)及免疫組化檢測(cè)

用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉處死大鼠后，解剖暴露腹腔內(nèi)各器官，尋找藥物包埋時(shí)所留的線結(jié)標(biāo)志，取下藥物包埋位置胰腺組織及周圍胰腺組織，所有組織標(biāo)本均放入10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲醛溶液進(jìn)行固定，固定時(shí)間為24 h，將固定好的胰腺組織進(jìn)行取材，所取組織盡量為藥物包埋周圍組織，石蠟包埋時(shí)切面朝向下方，包埋過程迅速，盡量避免組織塊變涼、蠟液凝結(jié)或出現(xiàn)氣泡。行切片、HE染色觀察腫瘤組織特征，免疫組化檢查采用常規(guī)S-P法確定腫瘤來源。一抗 SMA、CD117、Ki-67、Desmin和CD34均為鼠抗人單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。二抗EnVision購自Dako公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較使用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析方法。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較使用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物分組情況

實(shí)驗(yàn)組大鼠異常死亡5只(8%，5/60)，其余順利完成實(shí)驗(yàn)，死亡大鼠剔除實(shí)驗(yàn)入組。對(duì)照組大鼠無異常死亡，均按計(jì)劃完成實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物分組情況如表1。

表1 動(dòng)物分組Tab.1 Numbers of rats in two groups

2.2 大鼠體質(zhì)量變化

術(shù)后每個(gè)月稱量兩組大鼠體質(zhì)量，數(shù)據(jù)顯示實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠術(shù)后體質(zhì)量逐漸增加。觀察存活到6個(gè)月的2組大鼠(實(shí)驗(yàn)組18例，對(duì)照組3例)的體質(zhì)量變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.095)，詳見表2。

2.3 大體標(biāo)本及病理學(xué)檢測(cè)

2.3.1 大體標(biāo)本

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2個(gè)月胰腺大體標(biāo)本可見腸管擴(kuò)張，胰腺水腫，沿線結(jié)尋找到藥物包埋位置，埋藥處胰腺組織較其他位置稍硬，可見術(shù)中所植入DMBA晶體，淡黃色，被胰腺組織包裹成團(tuán)。術(shù)后4～6個(gè)月實(shí)驗(yàn)組大鼠胰腺病理大體標(biāo)本可見明顯結(jié)節(jié)，直徑約0.3 cm，結(jié)節(jié)質(zhì)韌，有一定彈性，剖開結(jié)節(jié)有液體流出，囊壁灰白色，與胰腺組織明顯不同(圖1)。術(shù)后6個(gè)月實(shí)驗(yàn)組1只大鼠解剖后可見血性腹水以及腹腔各器官粘連，左上腹部最為嚴(yán)重，胰腺置藥標(biāo)記處可見橢圓形占位，質(zhì)硬，切面呈灰白色、魚肉狀，診斷腫瘤可能性大(圖2)。對(duì)照組大鼠解剖后部分可見輕微粘連。

表2 術(shù)后存活到6個(gè)月的2組大鼠體質(zhì)量變化Tab.2 The weight change of rats in two groups after operation in 6 months kg

圖1 胰腺囊腫(A)，囊腫被剖開(B)Fig.1 Pancreatic cyst(A)and cyst was cut(B)

圖2 平滑肌肉瘤(A)，肉瘤被剖開(B)Fig.2 The leiomyosarcoma of the pancreas(A)and leiomyosarcoma was cut(B)

2.3.2 病理學(xué)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組大鼠胰腺置入DMBA 2個(gè)月后呈胰腺炎改變，鏡下可見中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，導(dǎo)管上皮增生(圖3A)。

4個(gè)月后大鼠鏡下可見胰腺組織多灶性壞死、部分組織退變、彌漫性纖維素樣壞死伴纖維化及灶狀鈣化、可見淋巴細(xì)胞浸潤，部分導(dǎo)管上皮修復(fù)性增生，未見明顯異形細(xì)胞，考慮胰腺囊腫(圖3B)。對(duì)照組大鼠鏡下表現(xiàn)基本為正常胰腺結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)明顯異常組織學(xué)改變。

6個(gè)月后1只大鼠胰腺置藥標(biāo)記處鏡下可見細(xì)胞異形，核分裂易見，可見多核巨細(xì)胞(圖4A、B)，免疫組化提示，Ki-67(10%+)，SMA(+)(圖 4C)，Desmin(+)(圖 4D)，CD34(-)，CD117(個(gè)別+)，考慮為平滑肌肉瘤。

實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后4個(gè)月胰腺囊腫發(fā)生率為33.3%(6/18)，6個(gè)月胰腺囊腫發(fā)生率38.9%(7/18)，使用Fisher確切概率法比較術(shù)后4個(gè)月、6個(gè)月胰腺囊腫發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)，6個(gè)月胰腺部位平滑肌肉瘤發(fā)生率為5.6%(1/18)，胰腺部位平滑肌肉瘤總發(fā)生率1.8%(1/55);無胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌發(fā)生。

圖3 實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后2個(gè)月及4個(gè)月病理學(xué)檢查.Fig.3 Pancreatitis were observed after 2 and 4 months of operation in experiment group

圖4 實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后6個(gè)月病理學(xué)檢查Fig.4 Pancreatitis were observed after 6 months of operation in experiment group

3 討論

DMBA是多環(huán)芳香烴類化合物，本身不具有致癌作用，但是在大鼠或小鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物會(huì)誘導(dǎo)胰腺產(chǎn)生PanIN和胰腺癌，機(jī)制是DMBA的代謝產(chǎn)物造成DNA損傷和染色體畸變，導(dǎo)致胰腺出現(xiàn)早期損害時(shí)就已經(jīng)引起了K-RAS基因和P53抑癌基因突變，最終發(fā)展成為胰腺癌［5］。相較于其他胰腺癌模型，DMBA誘導(dǎo)的胰腺癌模型能夠更加精確的模擬PanIN的進(jìn)展過程，這與人類胰腺癌的發(fā)展過程類似［6］。其次，DMBA可以促進(jìn)炎性反應(yīng)因子(IL-1、IL-12、IL-17、TNF-α)誘導(dǎo)癌癥發(fā)生，有助于研究炎性反應(yīng)致癌作用的機(jī)制［7-8］。

國內(nèi)外學(xué)者［9］用DMBA誘導(dǎo)大鼠胰腺癌模型成功，所用的劑量與時(shí)間各不相同，成瘤率波動(dòng)在17% ～39%。有文獻(xiàn)［3-4，10-11］報(bào)道 DMBA 誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰腺癌的劑量從1～10 mg不等，時(shí)間需要1～9個(gè)月。在本研究中，筆者采用小劑量DMBA(2 mg/100 g)置入SD大鼠胰腺內(nèi)的方法試圖建立胰腺癌動(dòng)物模型，55只大鼠術(shù)后體質(zhì)量增長曲線未見下降趨勢(shì)，病理學(xué)診斷顯示為急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺囊腫(23.6%，13/55)及平滑肌肉瘤(1.8%，1/55)。筆者系統(tǒng)的回顧了實(shí)驗(yàn)的經(jīng)過，并且查閱了更多的相關(guān)文獻(xiàn)，手術(shù)置入DMBA過程與國內(nèi)外報(bào)道基本一致，但為什么沒誘導(dǎo)出胰腺癌?

Druckey提出的“總和學(xué)說”和Berenblum提出的“兩階段學(xué)說”關(guān)于劑量和時(shí)間因素的影響可以用來解釋致癌劑的誘癌機(jī)制?！翱偤蛯W(xué)說”認(rèn)為單一致癌劑的特異性致癌效應(yīng)是不可逆的，當(dāng)實(shí)驗(yàn)中置入胰腺內(nèi)的DMBA劑量過小達(dá)不到致癌的閾值，可能會(huì)造成成瘤率過低或者成瘤時(shí)間過長，只有劑量達(dá)到致癌閾值時(shí)才有可能誘導(dǎo)成瘤。而“兩階段學(xué)說”認(rèn)為腫瘤發(fā)生包括啟動(dòng)階段和促進(jìn)階段兩個(gè)相互聯(lián)系的階段，啟動(dòng)階段指正常細(xì)胞在致癌劑作用下可能轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤的潛伏性(休眠的)瘤細(xì)胞，這是一個(gè)特異性且往往是不可逆的過程，其時(shí)間可能很短;促進(jìn)階段是非特異性的過程，指潛伏性瘤細(xì)胞在一定條件下發(fā)展為具有一定生物學(xué)及形態(tài)學(xué)特征的腫瘤，但是在不具備一定的條件時(shí)，休眠的瘤細(xì)胞也只可能停留在第一個(gè)過程。因此DMBA既存在閾下致癌劑量的問題，也存在劑量過高導(dǎo)致動(dòng)物短時(shí)間病死率增高的問題。在實(shí)驗(yàn)組，為了降低DMBA對(duì)大鼠的毒性，降低實(shí)驗(yàn)大鼠病死率，同時(shí)減少DMBA散落入腹腔的概率，筆者置入大鼠胰腺的DMBA的量為2 mg/100 g，低于國內(nèi)外類似實(shí)驗(yàn)使用量，導(dǎo)致潛伏期長于動(dòng)物本身壽命，未誘發(fā)出腫瘤，也有可能只引起了“兩階段學(xué)說”中的啟動(dòng)階段，使大鼠胰腺導(dǎo)管上皮產(chǎn)生了潛伏性的瘤細(xì)胞，但是并沒有進(jìn)一步發(fā)展進(jìn)入促進(jìn)階段，最終沒有導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。結(jié)果在6個(gè)月內(nèi)只誘導(dǎo)1例胰腺平滑肌肉瘤發(fā)生。

平滑肌肉瘤最常發(fā)生于胃腸道、腹膜后、尿道、子宮和軟組織，占肉瘤的2% ～9%，在所有胰腺惡性腫瘤里只占到 0.1%［12-14］。文獻(xiàn)［15］報(bào)道胰腺平滑肌肉瘤有可能起源于胰腺導(dǎo)管平滑肌，或者胰腺內(nèi)的小血管壁。Tan等［3］采用DMBA 9 mg置入SD大鼠胰腺，3～5個(gè)月內(nèi)誘導(dǎo)出17例胰腺導(dǎo)管腺癌和1例胰腺纖維肉瘤，胰腺癌發(fā)生率為48.7%。Taguchi等［16］將DMBA溶液注射入SD大鼠皮下，結(jié)果表明幼年SD大鼠肉瘤發(fā)生率高于成年SD大鼠，越高劑量的DMBA誘導(dǎo)肉瘤成功率越高。間葉干細(xì)胞具有分化成骨骼肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的能力，研究［16-17］表明肉瘤早期變化主要包括非典型成纖維或間葉細(xì)胞增生和集聚、毛細(xì)血管不規(guī)則增生等表現(xiàn)，由于缺乏肉瘤癌前病變階段典型的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和特異性表型，目前并不能確定非典型間葉細(xì)胞的集聚可以誘導(dǎo)癌前病變發(fā)展為惡性腫瘤或僅僅轉(zhuǎn)為非典型再生病變。所以，本實(shí)驗(yàn)筆者只發(fā)現(xiàn)了大鼠胰腺炎、胰腺囊腫和1例胰腺相應(yīng)解剖部位的肉瘤，胰腺部位平滑肌肉瘤的來源及形成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

致謝:感謝楊盈赤老師在造模及昌紅老師、石峰老師在病理診斷中給予的大力幫助。

［1］ Jimenez R E，Z'Graggen K，Hartwig W，et al.Immunohistochemical characterization of pancreatic tumors induced by dimethylbenzanthracene in rats［J］.Am J Pathol，1999，154(4):1223-1229.

［2］ Pan J J，Oh S H，Lee W C，et al.Bone marrow-derived progenitor cells could modulate pancreatic cancer tumorigenesis via peritumoral microenvironment in a rat model［J］.Oncol Res，2009，17(8):339-345.

［3］ Tan X G，Yang Z L，Yang L P，et al.Expression of DNA-repair proteins and their significance in pancreatic cancer and non-cancerous pancreatic tissues of Sprague-Dawley rats［J］.World J Surg Oncol，2014，12:32.

［4］ Guo J C，Li J，Yang Y C，et al.Oligonucleotide microarray identifies genes differentially expressed during tumorigenesis of DMBA-induced pancreatic cancer in rats［J］.PLoS One，2013，8(12):e82910.

［5］ Khalaileh A，Dreazen A，Khatib A，et al.Phosphorylation of ribosomal protein S6 attenuates DNA damage and tumor suppression during development of pancreatic cancer［J］.Cancer Res，2013，73(6):1811-1820.

［6］ Kimura K，Satoh K，Kanno A，et al.Activation of Notch signaling in tumorigenesis of experimental pancreatic cancer induced by dimethylbenzanthracene in mice［J］.Cancer Sci，2007，98(2):155-162.

［7］ Sharma S D，Meeran S M，Katiyar N，et al.IL-12 deficiency suppresses 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced skin tumor development in 7，12-dimethylbenz(a)anthracene-initiated mouse skin through inhibition of inflammation［J］.Carcinogenesis，2009，30(11):1970-1977.

［8］ Z'Graggen K，Warshaw A L，Werner J，et al.Promoting effect of a high-fat/high-protein diet in DMBA-induced ductal pancreatic cancer in rats［J］.Ann Surg，2001，233(5):688-695.

［9］ Zhu Z，Liu T，Han F，et al.Mutations in the p16 gene in DMBA-induced pancreatic intraepithelial neoplasia and pancreatic cancer in rats［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2015，14(2):208-214.

［10］Wang L，Liu H L，Li Y，et al.Proteomic analysis of pancreatic intraepithelial neoplasia and pancreatic carcinoma in rat models［J］.World J Gastroenterol，2011，17(11):1434-1441.

［11］ Wendt L R，Osvaldt A B，Bersch V P，et al.Pancreatic intraepithelial neoplasia and ductal adenocarcinoma induced by DMBA in mice:effects of alcohol and caffeine［J］.Acta Cir Bras，2007，22(3):202-209.

［12］Kocakoc E，Havan N，Bilgin M，et al.Primary pancreatic leiomyosarcoma［J］.Iran J Radiol，2014，11(2):e4880.

［13］舒紅，申敬偉，孫巖.原發(fā)性腹膜后平滑肌肉瘤十次轉(zhuǎn)移病灶手術(shù)病例分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(15):1191-1192.

［14］宋志文，陳永霞，曲林濤.原發(fā)性腹膜后腫瘤MR-DWI診斷價(jià)值的探討［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(12):946-947.

［15］ Xu J，Zhang T，Wang T，et al.Clinical characteristics and prognosis of primary leiomyo-sarcoma of the pancreas:a systematic review［J］.World J Surg Oncol，2013，11:290.

［16］Taguchi S，Kuriwaki K，Souda M，et al.Induction of sarcomas by a single subcutaneous injection of 7，12-dimethylbenz(a)anthracene into neonatal male Sprague-Dawley rats:histo-pathological and immunohistochemical analyses［J］.Toxicol Pathol，2006，34(4):336-347.

［17］ Tholpady S S，Katz A J，Ogle R C.Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro［J］.Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol，2003，272(1):398-402.