吳 媛 張 靜 董凌月 安 威

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069)

肝臟是一種具有多樣而復(fù)雜的生物學(xué)功能的人體生命器官，具有很強(qiáng)的再生功能，肝損傷引起的肝細(xì)胞數(shù)量減少和肝部分切除均可啟動(dòng)肝臟再生過(guò)程［1］。包括激素、生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞因子在內(nèi)的多種物質(zhì)均參與肝再生的調(diào)節(jié)，其中肝刺激因子(hepatic stimulator substance，HSS)目前受到廣泛的關(guān)注。HSS是1975年La Brecque從新生大鼠肝臟或鼠再生肝臟中分離到的一種活性物質(zhì)，由于具有特異性刺激肝細(xì)胞增生的特點(diǎn)，故謂之肝刺激因子［2］。HSS已被證明是唯一具有肝特異性的細(xì)胞因子，廣泛存在于哺乳動(dòng)物胚胎肝、幼胎肝以及再生肝胞漿液中，并且是由肝細(xì)胞自身分泌的［3］。除去上述的刺激肝細(xì)胞增生外，HSS還具有保護(hù)肝細(xì)胞免于CCl4、氨基半乳糖等毒物對(duì)肝臟的特異性損害［4-6］。它具有抗酸耐堿耐熱等特點(diǎn)并帶強(qiáng)負(fù)電荷(相對(duì)分子質(zhì)量介于14 000～20 000)［7］。HSS作為肝細(xì)胞源性活性因子可能在肝再生過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但具體機(jī)制仍不甚清楚。因此本研究利用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建成功的Flag-HSS-pcDNA3.0質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞，建立了穩(wěn)定表達(dá)HSS的細(xì)胞系，為深入研究HSS的生理功能提供實(shí)驗(yàn)工具和研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

BEL-7402細(xì)胞系(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系保存);高糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑(瑞士Roche公司);Mitotracker染劑(美國(guó)Molecular Probes公司);SYBR Green PCR Master Mix(德國(guó)GIAGEN公司);BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司);化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司);HSS多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);Flag單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗GAPDH抗體(上?？党晒?;羊抗鼠IgG抗體-辣根過(guò)氧化物酶，羊抗兔IgG抗體-辣根過(guò)氧化物酶(北京普利萊公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，在相對(duì)濕度95%、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2、37℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)BEL-7402細(xì)胞(人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系)，培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、含有青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的高糖 DMEM培養(yǎng)基。每24～48 h進(jìn)行一次傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

按FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書的操作方法將Flag-HSS-pcDNA3.0(本室保存)轉(zhuǎn)染入BEL-7402細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染前1 d按3×105/mL的密度接種細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中，使細(xì)胞達(dá)到80% ～90%的匯合率。用無(wú)抗生素?zé)o血清的opti-MEM培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒DNA(2 μg)至終體積100 μL;在培養(yǎng)基中加入4 μL脂質(zhì)體，渦旋1～2 s，室溫15 min;將6孔板中的培養(yǎng)基棄去，換用新鮮無(wú)抗生素的10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM培養(yǎng)基900 μL;加入含有質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的混合物100 μL，于5%CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h 后，加入無(wú)抗生素含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM培養(yǎng)基2 mL。轉(zhuǎn)染24 h后按1∶5傳代，用600 μg/mL終質(zhì)量濃度的G418進(jìn)行篩選，約12～15 d后肉眼可見單克隆細(xì)胞團(tuán)，挑取單克隆細(xì)胞團(tuán)，用含有300 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，之后收集細(xì)胞并分別提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞和野生型細(xì)胞的蛋白質(zhì)和mRNA，進(jìn)行Western blotting和real-time PCR實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫熒光(immunofluorescent，IF)

將厚為0.1 mm直徑為12 mm的蓋玻片放入24孔板，將野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞按2.5×105/孔接種于24孔板中，之后細(xì)胞貼壁于玻片上形成細(xì)胞爬片;用含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，加入200 μL含 Mitotracker染劑的 PBS(終濃度200 nmol/L)，37℃孵箱中避光染色25 min;PBS洗滌并加入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛，室溫固定細(xì)胞15 min;PBS洗滌，用 500 μL 0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100通透細(xì)胞，用500 μL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA進(jìn)行封閉30 min;每孔加入按1∶4 000稀釋的anti-Flag抗體，4℃過(guò)夜孵育;加入按1∶500稀釋的Alexa Flour 594熒光二抗，于室溫避光平緩搖動(dòng)1 h;DIPA復(fù)染細(xì)胞核;用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)

PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，此條件進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。將所擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行溶解曲線分析。18 s的Tm為84℃，HSS的Tm為87℃。檢測(cè)的臨界點(diǎn)在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)從本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段時(shí)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)看作模板初始濃度的間接指標(biāo)。結(jié)果用18 s進(jìn)行校正。用ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)，確定HSS mRNA相對(duì)定量。

1.6 Western blotting 分析

將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，在4℃條件下用細(xì)胞裂解液得到細(xì)胞蛋白，按 BCA蛋白檢測(cè)試劑盒中的方法進(jìn)行蛋白定量，配制聚丙烯酰胺凝膠(5%濃縮膠和12%分離膠)，50 μg待測(cè)樣品與上樣緩沖液共25 μL混勻后，99℃ 加熱10 min使蛋白變性。然后按順序加待測(cè)樣品及預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上樣，濃縮膠80 V，進(jìn)入分離膠后改為120 V恒壓電泳約1.5 h。之后進(jìn)行膜轉(zhuǎn)印，5% 封閉液(1.25 g脫脂奶粉+25 mL TBST配制)室溫封閉1 h，封閉結(jié)束后，將硝酸纖維膜放入按1∶5 000稀釋的一抗稀釋液中，搖床上4℃ 過(guò)夜;TBST沖洗3次，加入二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗IgG抗體，1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h后，TBST沖洗3次，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。洗膜后孵育內(nèi)參GAPDH，結(jié)果用密度分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較使用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選

Flag-HSS-pcDNA3.0轉(zhuǎn)染入BEL-7402細(xì)胞，經(jīng)600 μg/mL G418維持篩選后，大約13 d后抗G418(圖1A)細(xì)胞初步形成單克隆，挑取單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);首先移至96孔板中，每孔1個(gè)單克隆細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞覆蓋率80%以上時(shí)轉(zhuǎn)移至24孔板，如此依次擴(kuò)大培養(yǎng)至12孔板、6孔板和60 mm培養(yǎng)皿中，期間保持每種單克隆細(xì)胞的獨(dú)立性，即不與其他克隆交叉(圖1B)。將最終獲得的細(xì)胞命名為HSS-expressing細(xì)胞。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選Fig.1 Screening of stable transfected cell clones

2.2 免疫熒光染色觀察 HSS-expressing細(xì)胞中HSS的定位

野生型BEL-7402細(xì)胞和HSS-expressing細(xì)胞通過(guò)免疫熒光染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示(藍(lán)色熒光代表經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞核，紅色熒光代表經(jīng)Mitotracker染色的線粒體，綠色熒光代表經(jīng)Flag標(biāo)記的HSS):在野生型的BEL-7402細(xì)胞中，只有紅色熒光線粒體而沒有綠色熒光Flag-HSS;而在HSS-expressing細(xì)胞中，既有紅色熒光線粒體又有綠色熒光HSS的表達(dá)，疊加后顯示黃色(圖2)，這些結(jié)構(gòu)提示，成功將HSS基因整合入BEL-7402細(xì)胞的基因組中，HSS基因可以穩(wěn)定表達(dá)并定位于線粒體中。

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染HSS在BEL-7402細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及定位Fig.2 Expression and localization of HSS in BEL-7402 cells transfected HSS by confocal microscopic

2.3 HSS在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)

為了進(jìn)一步鑒定HSS-expressing細(xì)胞中HSS的表達(dá)情況，提取細(xì)胞的總RNA后，進(jìn)行real-time PCR試驗(yàn)。結(jié)果顯示:野生型BEL-7402和HSS-expressing細(xì)胞中HSS基因均有表達(dá)，而 HSS-expressing細(xì)胞中HSS表達(dá)較野生型細(xì)胞顯著上調(diào)(圖3)。

圖3 HSS mRNA在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.3 Analysis of HSS mRNA expression in wild type cells and BEL-7402 cells transfected HSS

2.4 HSS在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中蛋白質(zhì)水平的表達(dá)

通過(guò)Western blotting方法進(jìn)一步鑒定提取的野生型BEL-7402細(xì)胞和HSS-expressing細(xì)胞中HSS蛋白質(zhì)表達(dá)和兩種細(xì)胞中帶Flag標(biāo)簽的HSS融合蛋白的表達(dá)情況。如圖4A所示，HSS-expressing細(xì)胞中HSS蛋白質(zhì)表達(dá)較野生型細(xì)胞增加了6.8倍;而帶Flag標(biāo)簽的HSS融合蛋白在HSS-expressing細(xì)胞中表達(dá)同樣明顯高于野生型細(xì)胞(圖4B)。這些結(jié)果均提示，HSS在HSS-expressing細(xì)胞可以穩(wěn)定的高表達(dá)，可用于下一步的HSS功能的研究。

3 討論

HSS又稱為肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration，ALR 或 growth factor，augmenter of liver regeneration，GFER)［8-10］。從 1975 年發(fā)現(xiàn)至今，由于其在肝臟保護(hù)、促肝細(xì)胞增生及抑制凋亡等方面發(fā)揮重要作用，一直備受人們關(guān)注［11-14］。新近研究［15］顯示，利用條件性基因敲除技術(shù)，將肝臟內(nèi)的HSS選擇性的沉默后，肝臟很快發(fā)生脂肪性變性，并在正常飼養(yǎng)下，逐步發(fā)展成肝臟纖維化及肝癌。HSS作為一種線粒體蛋白，如何影響肝臟脂質(zhì)代謝，是目前HSS研究中需要解決的問(wèn)題。

將基因克隆到真核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，觀察宿主細(xì)胞的變化是研究基因功能及相關(guān)機(jī)制的一種有效方法。本研究應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒Flag-HSS-pcDNA 3.0成功轉(zhuǎn)染入人肝癌BEL-7402細(xì)胞后，選擇按1∶5的比例，進(jìn)行第一次傳代。通過(guò)G418篩選13 d后，獲得了具有抗性的陽(yáng)性單細(xì)胞克隆。在實(shí)驗(yàn)中，同樣選擇了1∶4和1∶6的比例，雖然1∶4的傳代比例相對(duì)于1∶5的比例，出現(xiàn)細(xì)胞克隆更早且更多，但是由于細(xì)胞密度大，導(dǎo)致細(xì)胞克隆并非始于單個(gè)祖細(xì)胞，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。而1∶6的比例，由于細(xì)胞過(guò)少，不容易生長(zhǎng)出細(xì)胞克隆，增加了篩選的難度。這個(gè)比例的建立，增加了獲得陽(yáng)性單細(xì)胞克隆的幾率，可用于其他穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HSS-expressing細(xì)胞系后，分別應(yīng)用real-time PCR和Western blotting方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平鑒定此細(xì)胞系是否正確表達(dá)HSS，結(jié)果顯示HSS在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可以被有效的轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于選用的真核表達(dá)載體含有Flag標(biāo)簽蛋白，本課題組還利用抗Flag標(biāo)簽的抗體檢測(cè)細(xì)胞中HSSFlag融合蛋白的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系建立成功。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，可以觀察單個(gè)細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)及分布。為此又進(jìn)行了免疫熒光實(shí)驗(yàn)，利用激光共聚焦顯微鏡可以觀察到，每個(gè)HSS-expressing細(xì)胞均有HSS的表達(dá)，且主要定位于線粒體中，與既往研究［16］相符，進(jìn)一步證實(shí)了HSS-expressing細(xì)胞可以有效準(zhǔn)確的表達(dá)HSS，并且具有良好的抗體結(jié)合活性，可以用于后續(xù)的研究。

綜上所述，本課題組成功的構(gòu)建了HSS穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，為研究HSS的生物學(xué)功能及相關(guān)機(jī)制提供了良好的細(xì)胞模型及研究工具。

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