盧劍清 鄧玉林

(北京理工大學生命學院，北京100081)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常在老年發(fā)生的神經退行性疾病，是目前世界上第二大神經退行性疾病，PD的一個重要病征就是黑質區(qū)多巴胺能神經元的喪失，但是目前其發(fā)病機制尚不清楚［1］。目前的關于PD病因的研究主要集中在遺傳因素和環(huán)境因素方面，其中在環(huán)境因素方面主要包括1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)、魚藤酮、百草枯等外源性神經毒素，多種實驗均證明此類神經毒素可引起多巴胺能神經元凋亡［2-3］。多巴胺與醛類縮合生成的兒茶酚四氫異喹啉(catechol tetrahydroisoquinolines，CTIQ)，例如與乙醛縮合形成兒茶酚異喹啉類神經毒素(salsolinol，Sal)，然后氮甲基化形成氮甲基去甲豬毛菜堿(N-methylsalsolinol，NMSal)，最后氧化生成異喹啉離子DMDHIQ+，其代謝過程如圖1所示［4］。而DMDHIQ+與MPP+是結構類似物，可以抑制線粒體復合體Ⅰ的活性，引起氧化應激，造成細胞凋亡［5-6］。而在此過程中，第一步的縮合反應和最后一步的氧化反應都可以通過自發(fā)反應或者酶促反應發(fā)生，而中間的氮甲基化反應則必須由酶促反應生成，所以氮甲基化是整個反應的較為關鍵的步驟。

圖1 DA生成CTIQ的代謝過程Fig.1 The metabolism from DA to CTIQ

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)是氮甲基化反應的甲基供體。近年來，SAM作為藥物或者保健品在肝損傷、抑郁癥等病癥的治療方面得到了應用［7］。而在PD方面，有研究［8］發(fā)現，經左旋多巴治療的PD患者體內出現SAM與S-腺苷-L-高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，SAH)比率的降低。臨床上有利用SAM治療PD患者的抑郁癥狀，改善患者生活品質，因此對于SAM對PD患者的安全性考察很有必要［9］。

本實驗采用多巴胺能神經元SH-SY5Y為模型，使用Sal以及SAM聯(lián)合的方式誘導細胞。綜合使用MTT、Hoechst 33258對核染色的方式檢測了其凋亡水平，檢測了胞內ATP的量，最后使用高效液相色譜法(high performance liquid chromatograph，HPLC)檢測了胞內Sal氮甲基化后的產物NMSal的量，通過這些實驗考察了SAM對Sal神經毒性的影響，以評價其在PD治療中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青)，0.25%(質量分數)胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)，ATP檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)，SAM、Sal、MTT、Hoechst 33258、偏亞硫酸氫鈉、Na2EDTA(美國 Sigma-Aldrich 公司)，NaCl、高氯酸等分析純試劑購自北京化學試劑公司。酶標儀(美國Thermo-Fisher公司，型號:Multiskan Ascent)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司，型號:TCS-SP5)，熒光素酶檢測儀(美國Promega公司，型號:2031)，HPLCECD(美國ESA公司，型號:6210)，五氟苯基柱(美國Sigma-Aldrich 公司，4.6 mm i.d. × 250 mm，5 μm)。

1.2 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞使用DMEM，10%(體積分數)胎牛血清，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 MTT 實驗

1.4 Hoechst 33258細胞核染色實驗

將細胞種植于蓋玻片上，置于6孔板中，按相應的濃度加藥后，孵育24 h。取出蓋玻片，PBS清洗后使用甲醇:冰乙酸(3∶1)4℃處理5 min固定細胞，蒸餾水漂洗干凈后使用20 μg/mL的Hoechst 33258室溫避光染色10 min，使用三蒸水洗3次，每次5 min。然后將蓋玻片用甘油-PBS封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡顯微鏡觀察，使用405 nm紫外光激發(fā)觀察核質固縮情況并拍攝。隨機選擇3個以上的視野，統(tǒng)計其中凋亡細胞的數量，并除以總細胞數，則為凋亡率。

1.5 ATP含量檢測

將細胞種入6孔板中，按相應的濃度加藥后，孵育24h。使用0.25%(質量分數)胰蛋白酶消化下來，1 000 r/min離心后，棄去上清。根據試劑盒說明書，加入100 μL裂解液，渦旋混勻，12 000 g，4℃離心10 min取上清。準備好標準品溶液和檢測工作液，將100 μL工作液加入離心管中，室溫放置3～5 min消除本底，加入20 μL標準品或者樣品后，迅速混勻，間隔2 s后用熒光素酶檢測儀測定，然后根據標準曲線計算樣品中ATP的絕對濃度。

1.6 HPLC-ECD測定NMSal的含量

將細胞種入10 cm培養(yǎng)皿，按相應濃度加藥后，孵育24 h，使用0.25%(質量分數)胰蛋白酶消化下來，1 000 r/min離心后，棄去上清，再使用PBS洗3次后重懸于200 μL PBS中。使用超聲破碎儀破碎細胞，功率210 W，超聲1 s，停2 s，超聲時間1 min。超聲完成后將樣品12 000 g，4℃離心10 min，取上清，以1∶10的比例加入2 mol/L的高氯酸(含0.4 mmol/L偏亞硫酸氫鈉和0.1 mmol/L的Na2EDTA)，12 000 g，4℃離心10 min除去蛋白，上清即為樣品。

樣品經0.22 μm濾頭過濾之后即可進樣，HPLCECD的檢測條件如表1所示。

表1 HPLC-ECD色譜條件Tab.1 Chromatographic condition of HPLC-ECD

1.7 統(tǒng)計學方法

所有數據均使用SPSS 13.0統(tǒng)計分析，所得結果以均數±標準差(±s)表示，組間比較使用單因素方差方法和LSD分析法，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SAM降低Sal誘導之后細胞的存活率

從圖2可以看出，在Sal的作用之下，SH-SY5Y細胞隨著Sal濃度的增加存活率逐漸下降，在400 μmol/L之前，下降的幅度不是很大，超過400 μmol/L之后，存活率越來越低，半數致死濃度約在800 μmol/L左右，當濃度超過1 000 μmol/L時，存活率急劇下降接近全部死亡。當使用100 μmol/L SAM同時誘導之后，在沒有加入Sal時，其存活率與正常細胞一致，說明SAM在此濃度之下本身不對細胞造成影響，在400 μmol/L時，其存活率與未加SAM的組也差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而當Sal的濃度達到500 μmol/L之后，可以明顯看到加入SAM共同誘導的細胞其存活率明顯下降，存活率下降的幅度在Sal濃度為500～1 000 μmol/L時基本保持一致。而當Sal濃度超過1 000 μmol/L后，由于細胞病死率太高，此時SAM并未表現出明顯的促進死亡的效應。

從以上結果可以看出，SAM可以增加Sal對多巴胺能神經元的毒性作用，并且這種促進作用并不隨著Sal濃度的增加而變大。

2.2 SAM增加Sal引發(fā)的細胞凋亡

凋亡細胞表現出細胞核核質固縮的效應，核體積變小，呈現深染的現象。圖3展示的就是使用Hoechst 33258對細胞核進行染色之后的結果，從圖3中可以看出，對照組和單獨使用100 μmol/L SAM處理組細胞核狀態(tài)正常，細胞核大小均一。而當加入500 μmol/L和1 000 μmol/L Sal后，細胞核出現了體積變小，核質固縮的現象，說明出現了細胞凋亡(圖3C和3E)。當加入100 μmol/L SAM后，細胞凋亡的情況更為嚴重(圖3D和3F)。圖3G表示的是統(tǒng)計了所有細胞之后的結果，從結果來看，SAM能夠顯著增加SH-SY5Y細胞在Sal誘導之下的凋亡程度。

2.3 SAM促進Sal引起的細胞內ATP量的減少

ATP是細胞內最重要的能量分子，其含量反映了細胞的活力。圖4展示了各組ATP量的結果，對照組和單獨使用100 μmol/L SAM誘導組其ATP濃度差異無統(tǒng)計學意義。當使用Sal誘導之后，ATP濃度開始下降，其中1 000 μmol/L Sal組ATP濃度下降的程度要高于500 μmol/L Sal組。當加入SAM共同孵育之后，可以看到與對應組相比，ATP濃度有了下降，而在1 000 μmol/L Sal組，ATP濃度具有顯著下降。

2.4 SAM增加Sal誘導之后細胞中NMSal的量

NMSal是多巴胺通過代謝生成毒性物質DMDHIQ+的重要的中間物質，也是Sal與SAM在氮甲基轉移酶的作用之下的直接產物，圖5A展示的是使用HPLC-ECD檢測的樣品中內源性神經毒素的量，其中箭頭所指的14 min左右的峰即為NMSal。圖5B為統(tǒng)計了各組細胞中NMSal的含量所得結果，從圖中可以看出，在對照和100 μmol/L SAM誘導的組中未檢測到有顯著的NMSal出現，說明此時內源性NMSal的量在檢測限之下。而當加入Sal之后，NMSal的水平大幅度增加，說明Sal代謝生成了NMSal，而當加入100 μmol/L SAM聯(lián)合誘導之后，NMSal濃度升高，其中在1 000 μmol/L Sal組 NMSal濃度顯著升高。這說明SAM作為生成NMSal的底物之一，它的加入可以促進Sal代謝成為NMSal。

圖2 MTT檢測細胞存活率Fig.2 The cell survival curve determined by MTT

圖3 Hoechst 33258對細胞核染色檢測細胞凋亡Fig.3 Apoptosis determined by the Hoechst 33258 stain nucleuses

3 討論

環(huán)境因素是目前PD發(fā)病機制的研究方向之一，而內源性神經毒素的研究是其中很重要的一個方面，CTIQs作為多巴胺的直接代謝產物，可以在很多方面解釋PD發(fā)病過程中多巴胺能神經元選擇性死亡的原因［10］。對于 CTIQs毒性機制的研究已有很多文獻［11-12］報道，Sal可以在SH-SY5Y細胞中引發(fā)氧化應激，造成GSH水平和ATP量下降，凋亡水平增加，同時激活JNK和NFκB等信號通路。NMSal的毒性要高于 Sal［13］，NMSal在體外可以引起羥基自由基的增加［14］，在NMSal的誘導之下，SH-SY5Y細胞呈現出核質固縮、DNA Ladder、caspase 3被激活等一系列凋亡相關現象，并且線粒體膜電位也隨之下降［15］。而在α-synuclein過表達以及Parkin敲低的PC12細胞中，能夠檢測到 salsolinol和 NMSal含量的顯著升高［16-17］。在大鼠體內，使用NMSal定位注射至大鼠腦部紋狀體區(qū)后，可以觀察到其行為學的改變，同時可以檢測到對應位置的多巴胺能神經元受到損傷［4］。

圖4 各組細胞中ATP量Fig.4 ATP content in the cells

圖5 HPLC-ECD檢測SH-SY5Y細胞中的NMSalFig.5 The NMSal level determined by HPLC-ECD in the SH-SY5Y cells

本課題中，使用Sal與SAM聯(lián)合誘導多巴胺能神經細胞SH-SY5Y，從結果來看，SAM可以促進Sal毒性作用的發(fā)揮，降低細胞存活率，并且引發(fā)細胞凋亡水平的增加。與此同時，Sal也可以破壞細胞的能量代謝穩(wěn)態(tài)，胞內ATP的含量降低，而SAM可以增加這種損傷的水平。而且在MTT的實驗結果可以看出，單獨使用SAM誘導細胞并不會影響細胞的存活率，這就說明了SAM增加Sal的毒性作用是因為其與Sal發(fā)生了相互作用引起的。在大鼠腦中，使用微透析的方式可以檢測到，輸入Sal之后生成了NMSal，這說明Sal在腦內可以生成 NMSal［18-21］。Naoi等［19］在腦內和淋巴細胞中檢測到了中性和堿性兩種氮甲基轉移酶可以催化Sal生成NMSal，并且這些酶的活性在PD患者中活性較高［20］。在本實驗中，通過 HPLC-ECD的檢測發(fā)現，SAM誘導之后，NMSal的生成量有顯著增加，這說明了SAM所引發(fā)的Sal毒性的增加可能是通過是Sal生成更多毒性較大的NMSal引起的。

通過以上結果證明了，在多巴胺能細胞中，SAM的加入可以增強內源性神經毒素Sal的毒性，因此SAM可能對PD的治療具有不利的效應。但是SAM除了引發(fā)Sal的毒性增加外，還有增強基因甲基化水平等其他效應，其綜合作用如何尚未有明確的結果，所以需要進行其他方面的研究才能最終確定SAM在PD治療方面的應用價值。

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