馬語曼 孫 琪 董 玉 王環(huán)愿 王 雯

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系 首都醫(yī)科大學(xué)代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069)

隨著人口老齡化進(jìn)程的日益加速，多種心腦血管疾病發(fā)生率迅速上升。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)和功能改變的重要原因，亦是血管衰老的主要特征之一，但其發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚。硝化應(yīng)激(nitrative stress)是指由一氧化氮(nitric oxide，NO)或由NO衍生的活性氮與活性氧共同聯(lián)合發(fā)生的生物化學(xué)作用，使蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基硝化成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)［1］，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性作用。老年時(shí)NO大量生成，但血管內(nèi)皮的生物活性卻不斷下降，是否與硝化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)?本研究通過觀察硝化應(yīng)激對(duì)衰老大鼠血管內(nèi)皮形態(tài)和功能的影響，探討衰老血管內(nèi)皮功能紊亂的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)3月齡(體質(zhì)量350～450 g)健康雄性SD(sprague dawley)大鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為:SCXK(京)2012-0001。SPF級(jí)20月齡(體質(zhì)量620～750 g)健康雄性SD大鼠，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為:SCXK(湘)2009-0012。

1.2 藥物與試劑

內(nèi)消旋-四(N-甲基-4-吡啶)卟啉五氯化鈉(Ⅲ)〔Fe(III)meso-tetra(N-methyl-4-pyridyl)porphine pentachloride，F(xiàn)eTMPyP，Cayman Chemical公司，美國〕;P53抗體和P21抗體(Abcam公司，美國);3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)抗體(Millipore公司，美國);β-actin、血管假性血友病因子(von willebrand factor，vWF)抗體、一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體、山羊抗兔 IgG/生物素標(biāo)記和山羊抗小鼠IgG/生物素標(biāo)記(Santa Cruz公司，美國);鹽酸去氧腎上腺素注射液(phenylephrine hydrochloride，PE，上海禾豐制藥有限公司，中國);乙酰膽堿(acetylcholine，Ach，Sigma-Aldrich 公司，美國);Hepes(Sigma-Aldrich，美國);小鼠超敏二步法檢測試劑盒購自中山金橋公司;NaCl、KCl、MgCl2、Glucose、CaCl2等普通試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器

微血管張力檢測系統(tǒng)(Myo Technology A/S公司，丹麥);PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(ADInstruments公司，澳大利亞);石蠟包埋機(jī)，石蠟切片機(jī)(Leica公司，德國;Western blotting電泳儀，Western blotting電轉(zhuǎn)儀，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥

3月齡和20月齡兩個(gè)年齡段健康雄性SD大鼠(SPF級(jí))各12只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分組如下:①青年對(duì)照組(3月齡對(duì)照組);②青年+過氧亞硝基(peroxynitrite，ONOO-)清除劑組(FeTMPyP，3 月齡);③老年對(duì)照組(20月齡對(duì)照組);④ 老年+過氧亞硝基清除劑組(FeTMPyP，20月齡)。實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食進(jìn)水。用0.9%氯化鈉注射液溶解FeTMPyP，配制成1 mg/mL的FeTMPyP溶液。采用腹腔注射的給藥方式，劑量為3 mg/kg。每3天1次，共5次。對(duì)照組給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。

1.4.2 Western blotting分析蛋白表達(dá)

取凍存肝臟組織按(組織 ∶RIPA裂解液 ∶蛋白酶抑制劑=100 mg∶1 mL∶10 μL)比例加入到1.5 mL EP管中，置冰上用眼科剪剪碎組織。4℃，12 000 r/min，離心10 min，吸取上清至一干凈的EP管中，BCA法檢測蛋白，于樣品中加入5×SDS-PAGE Loading buffer，99℃煮沸10 min，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。各組取40 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，250 mA，90 min蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h。一抗 P53或 P21(1∶1 000)和 β-actin(1∶500)分別4℃孵育過夜。次日取出，TBST洗膜3次。加入山羊抗小鼠IgG/生物素標(biāo)記的二抗或山羊抗兔IgG/生物素標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。用Bio-rad凝膠成像分析儀發(fā)光及分析結(jié)果。

1.4.3 離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)的制作及血管功能的檢測

處死動(dòng)物后，剪開胸腔，迅速游離胸主動(dòng)脈，置于盛有4℃預(yù)冷的Hepes液中，眼科剪小心去除動(dòng)脈周圍多余結(jié)締組織，將胸主動(dòng)脈剪成約2 mm的血管環(huán)，期間應(yīng)該避免過度牽拉和損傷血管內(nèi)皮。將血管環(huán)固定在張力測定系統(tǒng)中。通過逐步標(biāo)準(zhǔn)化將血管初始張力調(diào)到與100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)壓強(qiáng)時(shí)一致，此初始張力在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持穩(wěn)定不變。浴槽中持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體，37℃恒溫。平衡之后，給予濃度為60 mmol/L高鉀Hepes液預(yù)收縮血管。使用Hepes液將高鉀溶液洗脫平衡后，給予去氧腎上腺素(phenylephrine，PE)(10-5mol/L)刺激血管環(huán)使其收縮，待血管收縮穩(wěn)定后，以累積給藥的方式給予10-9～10-5mol/L的乙酰膽堿(Ach)，待累積反應(yīng)穩(wěn)定后，沖洗、平衡至基礎(chǔ)張力，開始下一輪實(shí)驗(yàn)。分別記錄每個(gè)濃度Ach刺激血管穩(wěn)定后的張力，并計(jì)算舒張率。舒張率(%)=(10-5mol/L PE刺激血管獲得的最大張力-10-9～10-5mol/L Ach刺激血管最大張力)/(10-5mol/L PE刺激血管獲得的最大張力-基礎(chǔ)張力)×100%。

1.4.4 免疫組織化學(xué)染色

處死動(dòng)物后，迅速剪取一段胸主動(dòng)脈用預(yù)冷的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液洗滌干凈后置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液充分固定。經(jīng)過從低到高的梯度乙醇脫水，二甲苯透明，不同熔點(diǎn)石蠟透蠟，高熔點(diǎn)石蠟進(jìn)行包埋后，按5 μm厚度切片，放入40℃溫水中展平，60℃烤24 h，自然冷卻至室溫備用。將載玻片置于梯度二甲苯、乙醇脫蠟，PBS沖洗后置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，微波高火加熱3 min，低火加熱15 min，冷卻至室溫。3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加一抗，4℃，靜置過夜。次日，取出載玻片，PBS沖洗，使用小鼠超敏二步法檢測試劑盒，37℃孵育聚合物輔助劑、辣根酶標(biāo)記抗小鼠IgG聚合物各15 min。DAB混合液顯色1 min，蘇木精染液染色1 min使細(xì)胞核著色，使用含有1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸的乙醇脫去非特異性染色。梯度乙醇二甲苯脫水，樹脂封片，顯微鏡觀察，對(duì)多個(gè)視野不同放大倍數(shù)拍照。

圖1 20月齡大鼠衰老相關(guān)蛋白P53/P21表達(dá)明顯升高Fig.1 Expression of aging-related proteins P53 and P21 in liver were increased significantly in aging rats

1.4.5 HE染色

將載玻片置于梯度二甲苯、乙醇脫蠟，PBS沖洗。蘇木精染液染色1 min使細(xì)胞核著色，用含1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸的乙醇脫去非特異性染色，0.5%伊紅染色2 min。梯度乙醇二甲苯脫水，樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間的檢驗(yàn)采用析因方差分析(factorial ANOVA)或重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析(repeated measurement data ANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20月齡大鼠衰老相關(guān)蛋白P53和P21表達(dá)升高

通過Western blotting方法檢測了衰老標(biāo)志蛋白P53和P21。結(jié)果顯示，與3月齡動(dòng)物相比，20月齡大鼠肝臟中P53和P21表達(dá)量均有顯著增加(分別P＜0.001，圖1)。

2.2 衰老大鼠血管組織硝化應(yīng)激反應(yīng)明顯增強(qiáng)

過氧亞硝基是NO與超氧陰離子結(jié)合生成的產(chǎn)物，可以硝基化蛋白質(zhì)上酪氨酸等氨基酸，形成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)。3-NT通常用來反映體內(nèi)硝化應(yīng)激的水平。本研究使用免疫組化的方法檢測了胸主動(dòng)脈3-NT的表達(dá)。結(jié)果顯示，20月齡大鼠胸主動(dòng)脈3-NT高于3月齡組(圖2)，這提示衰老血管中出現(xiàn)明顯的硝化應(yīng)激反應(yīng);采用過氧亞硝基的清除劑FeTMPyP干預(yù)可明顯降低3-NT。

圖2 胸主動(dòng)脈3-NT免疫組織化學(xué)染色Fig.2 Immunohistochemistry staining of 3-nitrotyrosine(3-NT)in thoracic aorta

2.3 抑制硝化應(yīng)激反應(yīng)可改善衰老血管內(nèi)皮依賴性舒張功能

為了檢測衰老血管內(nèi)皮功能的改變，觀察了胸主動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿(Ach)的舒張反應(yīng)。

20月齡衰老大鼠胸主動(dòng)脈(圖3)內(nèi)皮依賴性舒張功能較3月齡大鼠相比顯著下降。采用過氧亞硝基的清除劑FeTMPyP干預(yù)可明顯減輕衰老血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。

2.4 抑制硝化應(yīng)激反應(yīng)可減輕衰老血管形態(tài)學(xué)損傷

HE染色結(jié)果示20月齡衰老大鼠胸主動(dòng)脈較3月齡大鼠均出現(xiàn)較明顯的損傷，胸主動(dòng)脈內(nèi)皮標(biāo)志物血管假性血友病因子(von willebrand factor，vWF)及eNOS免疫組織化學(xué)染色示動(dòng)脈內(nèi)膜連續(xù)性破壞，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞丟失，著色較淺，連接間隙增大;采用過氧亞硝基的清除劑FeTMPyP干預(yù)可明顯減輕衰老血管形態(tài)學(xué)損傷，詳見圖4。

圖3 胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮依賴性舒張功能Fig.3 The endothelium-dependent diastoliation of thoracic aorta

3 討論

本課題在在體水平研究了硝化應(yīng)激在衰老所致血管內(nèi)皮損傷中的作用。本研究顯示衰老時(shí)機(jī)體的硝化應(yīng)激增加，可能參與衰老血管形態(tài)學(xué)損傷和血管內(nèi)皮依賴性舒張功能降低。

衰老是全世界面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。在中國，人口老齡化的形勢尤為嚴(yán)峻。衰老的表現(xiàn)是全身性的，全身所有器官在衰老時(shí)其功能均發(fā)生減退。由于血管肩負(fù)向全身供血的功能，它的衰老同時(shí)促進(jìn)著其他器官的功能障礙，尤其是心腦等重要器官，因而血管的衰老引起人們的格外關(guān)注。

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelium cells，VECs)是血管內(nèi)腔表面的連續(xù)單層扁平細(xì)胞，由胚胎時(shí)期的中胚層分化而來。正常成人約有1×1012個(gè)VECs，不僅構(gòu)成了血液與血管平滑肌之間的生理屏障，同時(shí)還具有重要的內(nèi)分泌功能，可合成和釋放多種內(nèi)皮衍生的血管活性因子。Ach可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放舒張血管物質(zhì)，如NO，最終導(dǎo)致血管舒張［2］。因此，Ach誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張可以用來反映內(nèi)皮調(diào)節(jié)平滑肌舒張活動(dòng)的能力。VECs結(jié)構(gòu)和功能的完整對(duì)維持心血管系統(tǒng)正常穩(wěn)態(tài)有著重要的意義。內(nèi)皮作為生理上防御動(dòng)脈粥樣硬化的“第一線”，各種物理、化學(xué)因素、炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)等因素均可影響血管內(nèi)皮增生活性，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、脫落，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)而影響血管內(nèi)皮正常的生理功能，最終導(dǎo)致一系列心血管事件的發(fā)生。目前認(rèn)為，內(nèi)皮功能障礙是各種心血管疾病發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)［3］。已有研究顯示衰老是一種引起血管內(nèi)皮功能障礙的危險(xiǎn)因素［4］，同時(shí)很多文獻(xiàn)報(bào)道了衰老器官中 ONOO-增加的現(xiàn)象，比如心臟［5］、肝臟［6］、腎［7］和腦［8］等。ONOO-在衰老機(jī)體廣泛的分布源于衰老器官誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表達(dá)升高以及衰老機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高。ONOO-是參與硝化應(yīng)激的重要活性氮(reactive nitrogen species，RNS)之一，雖然 ONOO-極不穩(wěn)定，不易被直接檢測到，但其可與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝化反應(yīng)生成3-NT，目前以3-NT來代表體內(nèi)ONOO-生成的印跡。本實(shí)驗(yàn)中，通過 Western blotting方法檢測了衰老標(biāo)志蛋白P53和P21。與3月齡動(dòng)物相比，20月齡大鼠肝臟中P53和P21表達(dá)量均有顯著增加，表明本課題組所選用的自然衰老動(dòng)物模型是可信的。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法測定胸主動(dòng)脈中3-NT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于3月齡大鼠，20月齡大鼠胸主動(dòng)脈3-NT的表達(dá)明顯增加，提示20月齡大鼠出現(xiàn)明顯的硝化應(yīng)激反應(yīng)。FeTMPyP是一種水溶性的金屬卟啉類化合物，通過催化ONOO-轉(zhuǎn)化為硝酸鹽(＞90%)而減輕其毒性，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。已有報(bào)道［9］顯示，F(xiàn)eTMPyP可改善糖尿病大鼠的腎臟功能、減輕順鉑誘導(dǎo)的腎損傷及離體細(xì)胞中ONOO-的毒性反應(yīng)等。研究［10］表明，F(xiàn)eTMPyP可特異性作用于ONOO-，且對(duì)NO和O2-并無影響。本課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過使用FeTMPyP腹腔注射對(duì)20月齡大鼠進(jìn)行抗硝基化干預(yù)后，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)損傷減輕，血管內(nèi)皮依賴性舒張功能得到改善。本研究通過觀察自然衰老大鼠中硝化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮形態(tài)和功能的影響，初步表明衰老時(shí)增強(qiáng)的硝化應(yīng)激參與了血管內(nèi)皮損傷。而衰老時(shí)增強(qiáng)的硝化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

圖4 胸主動(dòng)脈HE染色，內(nèi)皮標(biāo)志物vWF和eNOS免疫組織化學(xué)染色Fig.4 HE staining of thoracic aorta and immunohistochemistry staining of endothelium marker vWF and eNOS in thoracic aorta

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