魯玲玲 施予晴 魏雨菲 賈煥珍 喬芳偉 楊 慧

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系 北京市腦重大疾病研究院 北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069)

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)由 140 個(gè)氨基酸構(gòu)成，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前末梢和細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。它與帕金森病(Parkinson’s disease，PD)密切相關(guān)。首次將α-syn與PD聯(lián)系起來(lái)的是Polymeropou-los與Krüger的研究小組，他們發(fā)現(xiàn)α-syn的錯(cuò)義突變(A53T與A30P)可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性PD［1-2］。并且它還是PD特征性病變-路易體(Lewy bodies，LBs)與路易神經(jīng)突(Lewy neurites)的主要成分［3-8］。對(duì)αsyn轉(zhuǎn)基因果蠅和大鼠的研究［9-10］顯示，過(guò)量的α-syn會(huì)導(dǎo)致大鼠與果蠅腦內(nèi)黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元丟失。在猴腦的黑質(zhì)部位過(guò)表達(dá)α-syn基因，也取得了類似的結(jié)果。有意思的是，過(guò)表達(dá)α-syn并不影響非DA能神經(jīng)元。那么，α-syn是如何導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的選擇性丟失的呢?迄今為止，該問(wèn)題仍無(wú)確切答案。但是，根據(jù)DA神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA獨(dú)特的合成、分解、儲(chǔ)存與重?cái)z取過(guò)程。這種選擇性損傷很可能與DA穩(wěn)態(tài)有關(guān)。而研究［11-15］表明，α-syn在多巴胺的合成、儲(chǔ)存、釋放與重?cái)z取中起重要作用，即α-syn與DA穩(wěn)態(tài)維持關(guān)系密切。

PTEN誘導(dǎo)的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)突變后可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性PD。研究［6］顯示 PINK1 是除了 α-syn、synphilin-1 以外的第三種參與LB體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物的蛋白，包括尸檢的LBs體中同時(shí)檢出PINK1和α-syn。PINK1與PD發(fā)病關(guān)系密切，亦是眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。但其確切的功能與突變后致病機(jī)制仍不清楚。在果蠅模型中，PINK1突變可以引起部分腦區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽(yáng)性神經(jīng)元的減少，以及DA的減少［16-17］。在斑馬魚模型中，PINK1功能缺失同樣可以引起TH陽(yáng)性神經(jīng)元及DA下降［18-19］。表明PINK1也與DA神經(jīng)元內(nèi)DA穩(wěn)態(tài)的維持有關(guān)。

核受體相關(guān)因子1(nuclear receptor related 1，Nurr1)，是在中腦部位高豐度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。其調(diào)控的靶基因包括TH、多巴脫羧酶(L-DOPA decarboxylase，DDC)、DA 轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter，DAT)與單胺囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體2(vesicular monoamine transporter 2，VMAT-2)。而TH與DDC是DA合成所需要的酶，DAT負(fù)責(zé)重?cái)z取被釋放至突觸間隙的DA，VMAT-2則負(fù)責(zé)將胞質(zhì)內(nèi)DA攝取并儲(chǔ)存至突觸囊泡中。由此可見，Nurr1與DA穩(wěn)態(tài)維持關(guān)系密切。

α-syn、PINK1與Nurr1這3個(gè)與DA穩(wěn)態(tài)維持關(guān)系密切的相關(guān)分子，目前關(guān)于它們之間關(guān)系的研究未見報(bào)道。那么，α-syn與PINK1是否通過(guò)與Nurr1的作用而參與DA穩(wěn)態(tài)維持呢?為解答上述問(wèn)題，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)技術(shù)檢測(cè)了α-syn與Nurr1之間的相互作用，并在PINK1基因敲減的MN9D細(xì)胞模型中檢測(cè)PINK1對(duì)Nurr1活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SK-N-SH)，美國(guó)ATCC公司(貨號(hào)HTB-11TM)。MN9D細(xì)胞(小鼠多巴胺能神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株)由瑞士Novartis公司惠贈(zèng)。質(zhì)粒 pAmCyan1-N1-α-syn(CFP-α-syn)與 pZsYellow1-N1-Nurr1(YFP-Nurr1)由本室構(gòu)建。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;RIPA裂解液購(gòu)于北京普利萊基因有限公司;蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購(gòu)于美國(guó)Merck公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogene公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染

SK-N-SH細(xì)胞采用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清DMEM培養(yǎng)基。MN9D細(xì)胞采用含10%(體積分?jǐn)?shù))新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中SK-N-SH細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染CFP-α-syn與YFP-Nurr1等質(zhì)粒，用于FRET檢測(cè)。MN9D細(xì)胞則轉(zhuǎn)染針對(duì)PINK1設(shè)計(jì)的小干擾RNA片段以敲減 PINK1。小干擾 RNA片段如下:PINK1 5’GGAGCAGTTACTTACAGAAGA3’，Scramble:5’GGATTGATTCAACACGGAAGA3’，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 激光共振能量轉(zhuǎn)移

將重組融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒CFP-α-syn、YFPNurr1分別或等比例混合轉(zhuǎn)染SKN-SH細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)FRET;轉(zhuǎn)染方法同前。

實(shí)驗(yàn)共分9組:①單獨(dú)轉(zhuǎn)染CFP空載體的SKNSH細(xì)胞(CFP，校正組，用于校正光譜串?dāng)_);② 單獨(dú)轉(zhuǎn)染YFP空載體 的SKN-SH細(xì)胞 (YFP，校正組，用于校正光譜串?dāng)_);③共轉(zhuǎn)染CFP空載體與YFP空載體的SKN-SH細(xì)胞(CFP/YFP，陰性對(duì)照組);④ 單獨(dú)轉(zhuǎn)染 CFP-α-syn 的 SKN-SH 細(xì)胞(CFP-α-syn，校正組，用于校正光譜串?dāng)_);⑤單獨(dú)轉(zhuǎn)染YFP-Nurr1的SKNSH細(xì)胞(YFP-Nurr1，校正組，用于校正光譜串?dāng)_);⑥共轉(zhuǎn)染 CFP-α-syn與 YFP空載體的 SKN-SH細(xì)胞(CFP-α-syn/YFP，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組);⑦ 共轉(zhuǎn)染CFP空載體與YFP-Nurr1的SKN-SH細(xì)胞(CFP/YFP-Nurr1，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組);⑧ 共轉(zhuǎn)染 CFP-α-syn和 YFP-Nurr1的SKN-SH 細(xì)胞(CFP-α-syn/YFP-Nurr1，實(shí)驗(yàn)組);⑨ 單獨(dú)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒CFP-YFP的SKN-SH細(xì)胞(CFP，YFP，陽(yáng)性對(duì)照組)。

CFP-α-syn作為FRET供體，YFP-Nurr1融合蛋白作為受體;用對(duì)照組樣品調(diào)整參數(shù)，首先設(shè)定供體熒光掃描參數(shù):激發(fā)光的波長(zhǎng)405 nm，光電倍增管(PMT)1對(duì)應(yīng)發(fā)射光波長(zhǎng)為475 nm，PMT2對(duì)應(yīng)發(fā)射光波長(zhǎng)為527 nm;設(shè)定受體熒光掃描參數(shù):激發(fā)光波長(zhǎng)514 nm，PMT2產(chǎn)生激發(fā)供體的圖像，調(diào)整激發(fā)光的強(qiáng)度以及PMT增益，獲得理想的熒光圖像。用實(shí)驗(yàn)組樣品進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)供體熒光，同時(shí)檢測(cè)供體和受體的熒光，并應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡提供的軟件計(jì)算FRET效率，計(jì)算公式如下:E=R06/(R6+R06)，R是供體與受體在生物條件下的距離，R0是每對(duì)供受體之間的一個(gè)常數(shù)，代表能量轉(zhuǎn)移的效率為50%時(shí)的距離。

1.4 雙熒光素酶法(dual luciferase assay)檢測(cè)Nurr1轉(zhuǎn)錄激活活性

相應(yīng)組別的MN9D細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染phRL-TK質(zhì)粒和其他各種目的質(zhì)粒(空啟動(dòng)子的pGL3-Basic作陰性對(duì)照，pGL3-Control質(zhì)粒作陽(yáng)性對(duì)照)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用200 μL的 PBS緩沖液洗滌2遍，40 μL雙熒光報(bào)告分析系統(tǒng)中的細(xì)胞裂解液裂解，室溫輕柔振搖15 min，-80℃保存待檢。所有待檢樣本室溫融化，每空加入100 μL檢測(cè)液Ⅱ，用TD-20/20熒光分析儀檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性。接著在每孔中加入100 μL反應(yīng)終止液，同樣用TD-20/20熒光分析儀檢測(cè)海腎熒光素酶活性。用公式計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用ANOVA進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFP-α-syn與YFP-Nurr1質(zhì)粒載體的構(gòu)建與酶切鑒定

α-syn及Nurr1的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)BglⅡ/SalⅠ和XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切，分別插入經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pZsYellow1-N1及pAmCyan1-N1真核表達(dá)載體，連接后轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞DH5α，小提酶切經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察，結(jié)果顯示獲得條帶大小分別為420 bp和1 800 bp，與目的基因大小相符。(圖1)初步表明CFP-α-syn和YFP-Nurr1的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒連接正確。進(jìn)一步對(duì)載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示插入片段的序列與目的基因完全吻合。證明成功構(gòu)建了進(jìn)行FRET檢測(cè)所需要的質(zhì)粒載體。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of the recombinant plasmids of pAmCyan1-N1-α-syn and pZsYellow1-N1-Nurr1

2.2 CFP-α-syn與YFP-Nurr1熒光融合蛋白在SKN-SH細(xì)胞中表達(dá)

在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000介導(dǎo)下，將上述構(gòu)建的CFP-α-syn與YFP-Nurr1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SK-N-SH細(xì)胞。24 h后分別在Confocal激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)CFP與YFP的熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示CFP-αsyn與YFP-Nurr1均可很好地在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且二者的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，并未因融合了目的蛋白而出現(xiàn)熒光減弱的現(xiàn)象。此外，α-syn在胞質(zhì)胞核均有分布，而Nurr1的分布以胞核為主。二者在亞細(xì)胞分布上存在共定位，有發(fā)生相互作用的基礎(chǔ)。詳見圖2。上述結(jié)果表明本課題組具備了FRET檢測(cè)的工作條件。

2.3 FRET檢測(cè)結(jié)果提示α-syn與Nurr1之間可能存在相互作用

FRET結(jié)果顯示:CFP組、CFP-α-syn組均可見到CFP(青色)熒光表達(dá);CFP-α-syn的熒光分布如前所述，在胞質(zhì)胞核均有分布;轉(zhuǎn)染YFP、YFP-Nurr1的細(xì)胞亦有熒光表達(dá)，為了區(qū)別FRET通道的黃色熒光，用紅色熒光代替，其熒光主要分布在細(xì)胞的胞核中;而共轉(zhuǎn)染 CFP和 YFP、CFP-α-syn和 YFP-Nurr1及單轉(zhuǎn)染CFP-YFP的細(xì)胞可同時(shí)檢測(cè)到青色熒光蛋白和 紅色熒光蛋白。

圖2 CFP-α-syn和YFP-Nurr1在SK-N-SH細(xì)胞中表達(dá)Fig.2 Expression of the reconstructed plasmids in SK-N-SH cells

用激發(fā)光波長(zhǎng)為405 nm、發(fā)射光為475 nm的激光檢測(cè)共轉(zhuǎn)染CFP-α-syn和YFP-Nurr1的細(xì)胞獲得青色熒光圖像;用激發(fā)光波長(zhǎng)為514 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)為527 nm的激光檢測(cè)共轉(zhuǎn)染CFP-α-syn和YFP-Nurr1的細(xì)胞獲得紅色(替代黃色)熒光圖像;參數(shù)(激發(fā)光的激發(fā)強(qiáng)度和PMT值)不變，用激發(fā)光波長(zhǎng)為405 nm激發(fā)，可檢測(cè)到黃色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(圖3)。計(jì)算其FRET發(fā)生效率，陰性對(duì)照組為2%，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組CFP-α-syn/YFP組與CFP/YFP-Nurr1組分別為4.41%與6.95%，而 CFP-α-syn和 YFP-Nurr1的 FRET效率為20.52%，與上述對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。提示有FRET現(xiàn)象的發(fā)生，詳見圖3。

2.4 成功制備PINK1表達(dá)沉默的MN9D細(xì)胞模型

轉(zhuǎn)染PINK1小干擾RNA 24 h和48 h后，分別提取全細(xì)胞蛋白，用Western blotting方法檢測(cè)PINK1蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示在RNA干擾24 h后，轉(zhuǎn)染干擾片段的MN9D細(xì)胞(knock down組，簡(jiǎn)稱KD組)，其蛋白表達(dá)較未作任何處理的MN9D細(xì)胞(簡(jiǎn)稱N)或轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)系列對(duì)照組(簡(jiǎn)稱Con組)均明顯降低(P＜0.01)。RNA干擾48 h后，KD組PINK1蛋白表達(dá)較N組或Con組均顯著降低(P＜0.01)，干擾效率高達(dá)70%，詳見圖4。

2.5 在 MN9D細(xì)胞中，PINK1基因被敲減后，其Nurr1的轉(zhuǎn)錄激活活性出現(xiàn)一定程度下調(diào)

在RNA干擾24 h和48 h后，分別進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。結(jié)果顯示，在PINK1基因被干擾(KD組)24 h后，其熒光素酶活性(反映Nurr1轉(zhuǎn)錄激活活性)下降至約44%;PINK1基因被干擾48 h后，熒光素酶活性下降至約42%。與未處理MN9D細(xì)胞及對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)說(shuō)明PINK1對(duì)于 Nurr1的轉(zhuǎn)錄激活活性具有一定的調(diào)節(jié)作用(圖5)。

圖3 CFP-α-syn和YFP-Nurr1之間FRET分析Fig.3 FRET efficiency analysis

圖4 PINK1干擾效率檢測(cè)Fig.4 Western blotting analysis to evaluate the efficiency of RNAi

圖5 雙熒光素酶活性檢測(cè)Fig.5 Dual luciferase assay

3 討論

在本研究中，本課題組利用FRET技術(shù)檢測(cè)αsyn與Nurr1之間相互作用。FRET是一個(gè)依賴于供體和受體間空間距離的偶極非輻射過(guò)程，該技術(shù)可以準(zhǔn)確靈敏地反映1 nm～10 nm范圍的空間距離的變化［20-22］。由于FRET效率依賴于供體受體分子間空間距離6次方的倒數(shù)，所以FRET技術(shù)成為研究生物單分子間相互作用及其構(gòu)像變化的重要技術(shù)之一［23-24］。隨著探測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是綠色熒光蛋白及其突變體的發(fā)現(xiàn)和改進(jìn)，使得FRET技術(shù)也成為在單個(gè)活細(xì)胞中實(shí)時(shí)長(zhǎng)時(shí)間追蹤單分子動(dòng)態(tài)行為特征的主要技術(shù)之一。

將目的蛋白α-syn與Nurr1分別與CFP與YFP相融合形成融合蛋白。在Confocal激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)，觀察到了FRET現(xiàn)象的發(fā)生。經(jīng)過(guò)計(jì)算其FRET效率約為21%。這提示α-syn與Nurr1之間可能存在直接相互作用。但是，如要確定二者的作用可能還需要免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)、GST Pulldown或酵母雙雜交等的進(jìn)一步驗(yàn)證。

有研究［25-26］表明，過(guò)表達(dá)α-syn可抑制 TH與芳香族氨基酸脫羧酶(aromatic acid decarboxylase，AADC)的表達(dá)，因此推測(cè)α-syn可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子，通過(guò)與Nurr1相互作用而抑制其活性，進(jìn)而導(dǎo)致其下游靶基因TH與AADC(DDC)降低。

對(duì)于PINK1基因敲減的MN9D細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著PINK1被敲減，其Nurr1轉(zhuǎn)錄激活活性降低。表明正常情況下，PINK1對(duì)Nurr1應(yīng)具有正性調(diào)控作用。這與之前的一些報(bào)道［16-19］，認(rèn)為PINK1突變或功能缺失后，其DA降低的觀點(diǎn)是一致的。這種作用可能是PINK1通過(guò)對(duì)Nurr1活性的調(diào)節(jié)所導(dǎo)致的。

有研究［27-28］報(bào)道顯示 PINK1可調(diào)節(jié) α-syn的表達(dá)和蛋白的聚集。PINK1突變導(dǎo)致的PD患者的成纖維細(xì)胞中，實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示α-syn上調(diào)了5倍以上［29］;在SH-SY5Y細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染α-syn和PINK1的干擾片段，熒光顯微鏡下可以看到明顯的α-syn聚集。而本課題組的前期研究，通過(guò) Co-IP、FRET及GST pulldown的方法證明PINK1與α-syn之間可能存在相互作用。這提示二者對(duì)于Nurr1的調(diào)節(jié)可能也存在相互協(xié)調(diào)相互制約的作用。PINK1對(duì)Nurr1是正性調(diào)節(jié)，α-syn是負(fù)性調(diào)節(jié)作用。二者之間可能通過(guò)多種途徑相互制約，相互平衡，從而維持Nurr1功能在一個(gè)正常生理水平，并最終參與維持DA的穩(wěn)態(tài)。

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